用杆状病毒-昆虫细胞系统表达、纯化重组的人源化氨基末端LBP

根据已有的资料显示LBP与LPS的结合位点位于其氨基末端的第 91～ 1 0 0个氨基酸残基。在体外构建含有人LBP与LPS结合活性部分的穿梭质粒pBacmidtLBP ,并且带上 6×his的标签 ,用此穿梭质粒转染sf2 1昆虫细胞 ,获得重组病毒。然后用重组病毒液感染对数生长期的sf2 1昆虫细胞 ,72h后收获含有这种截断型人源化氨基末端LBP (NH LBP)的培养上清。用金属亲和树脂纯化后 ,采用SDS PAGE电泳以及Western Blot鉴定所得到的纯化物。成功获得相对分子质量约为 30 0 0 0的NH LBP。为进一步研究LBP在介导LPS活化靶细胞中的作用机制奠定了基础。

抗氨基端脂多糖结合蛋白单链抗体的生物学活性研究

目的观察制备的抗NHLBP单链抗体的体内外生物学活性`。方法采用流式细胞术观察抗NHLBP单链抗体阻断LPS与U937细胞的结合能力;采用ELISA法检测抗体干预后不同时相点的烧伤合并内毒素血症小鼠血浆中炎性细胞因子TNFα、IL6含量的变化;同时观察小鼠部分内脏器官的病理形态学改变。结果经抗NHLBP单链抗体干预后,U937细胞表面的荧光强度明显下降。烧伤合并内毒素血症小鼠经scFv抗体干预后,与模型组相比肝、肺组织的炎性改变明显减轻、浸润的炎细胞减少;肾组织的炎性改变不明显;小鼠血浆中TNFα浓度在烧伤合并内毒素处理后即显著增高,模型组与对照组相比,差异有显著性(P<0.01,P<0.05),干预组与相应时相点的模型组相比,在最初3h内差异有显著性(P<0.05)。IL6含量在建模3h以后与对照组相比差异有显著性(P<0.01,P<0.05);干预后IL6的含量下降比较明显。结论抗人源化氨基端脂多糖结合蛋白的单链抗体对内毒素血症有一定的保护作用;进一步明确了LBP在内毒素生物学效应中的作用。

抗氨基末端脂多糖结合蛋白基因工程抗体库的构建及体外表达筛选

目的构建人源化的单链可变区抗体库,运用体外表达技术翻译并筛选特异性的抗NHLBP抗体。方法分离健康人外周血单核细胞,抽提总RNA设计引物,扩增抗体轻重链的可变区,通过一段柔性片段将其连接成单链抗体库;应用体外表达技术翻译抗体库,并筛选出与NHLBP高度结合的单链抗体片段。结果扩增的单链抗体可变区片段分别为340bp和325bp,经连接后约为750bp。经过体外表达得到了约27000的抗体片段,经过5轮筛选进化,得到了可与NHLBP高度结合的抗体。结论已成功构建了人源化的单链抗体库;通过体外表达技术筛选到可与NHLBP高度结合的抗体。