NHS-MAG_3为螯合剂的^(99m)Tc-寡核苷酸标记特性

目的 探讨以 NHS- MAG3作为螯合剂的 99m Tc-寡核苷酸 (99m Tc- ON)的标记特性。方法 将 NHS-MAG3与长度为 15个碱基的 c- m yc m RNA的反义 (ASON)、正义 (SON)和无义寡核苷酸 (MON)偶联 ,进行 99m Tc标记 ,Sephadex G2 5柱层析分离纯化 ,评价 99m Tc- ON的标记率、放化纯和稳定性 ;将 ON- MAG3偶联物置 - 2 0℃贮存 15 d、1月、2月后进行 99m Tc标记 ,观察标记率的变化 ,评价 ON- MAG3的稳定性 ;用三氯乙酸沉淀法测定 99m Tc-ON的血浆蛋白结合率。结果 99m Tc- ASON、99m Tc- SON和 99m Tc- MON的标记率分别为 6 8.4 1%、6 6 .2 4 %和6 9.38% ,纯化后放化纯分别为 96 .98%、95 .34%和 94 .6 2 %。三者在室温和血清中均较稳定。 ON- MAG3在 - 2 0℃保存 2月后 ,标记率未见明显下降。三种 99m Tc- ON的血浆蛋白结合率均小于 13%。结论 以 NHS- MAG3作为螯合剂的 99m Tc- ON具备优良的标记特性 ,标记率、放化纯较高 ,稳定性好 ,血浆蛋白结合率低 。

^(188)Re间接标记单克隆抗体的研究

采用先标记后偶联的方法 ,以NHS -MAG3 为双功能连接剂 ,研究了用188Re标记单克隆抗体的各种实验条件 ,得到了最佳标记方法和偶联方法。标记抗体188Re -NHS -MAG3 -IgG体外稳定性良好。完成了188Re -NHS -MAG3 -CL3在小鼠体内的生物分布实验 ,结果表明该配合物在体内稳定性良好。

^(99m)Tc间接标记单克隆抗体的研究

以NHS MAG3为双功能连接剂 ,采用先标记后偶联的方法 ,研究了用99mTc标记单克隆抗体的各种实验条件 ,得到了最佳标记方法和偶联方法 .标记抗体99mTc NHS MAG3 IgG体外稳定性良好 .进行了99mTc NHS MAG3 CL3在小鼠体内的生物分布测定 .结果表明 ,该配合物在小鼠体内稳定性良好 ,在胃、肠、心中摄取最低 ,在肾 ,肝中摄取最高 .

人端粒酶催化亚单位(hTERT)反义分子探针的制备与理化性质初步研究

制备放射性核素99Tcm标记的针对人端粒酶催化亚单位(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)mRNA的反义分子探针,探讨其在体外的稳定性和相关理化性质。针对hTERT mRNA(GEN-BANK号为AF015950)的第2331~2348位核苷酸(含18个碱基),即5′-TCAAGAGCCACGTCTCTA-3′(hTERT SON),设计反义寡核苷酸序列(hTERT ASON)为5′-TAGAGACGTGGCTCTTGA-3′;对hTERTASON进行适当修饰。通过双功能螯合剂S-Acetyl NHS-MAG3进行放射性核素99Tcm标记。针对影响标记的主要因素(SnCl2用量、反应体积、反应时间等)进行条件摸索,建立最优化标记方案。纸层析法测定反义分子探针(99Tcm-hTERT ASON)的标记率和放射化学纯度,计算比活度。检测99Tcm-hTERT ASON的放射稳定性与序列稳定性,以及血清蛋白结合率。所有结果通过统计学软件SPSS12.0进行分析。室温下反应15~30 min后,99Tcm-hTERT ASON的标记率为76%±5%(n=5);在相同条件下,无双功能螯合剂作用,ASON的标记率仅为5.0%±1.6%(n=5);二者比较有显著差异(P<0.05)。99Tcm-hTERT ASON放射化学纯度达到96%以上,比活度为1 850 GBq/g。在不同条件下,99Tcm-hTERT ASON的放射化学纯度在24 h内均达到93%以上。PAGE凝胶电泳显示99Tcm-hTERT ASON在与人新鲜血清37℃孵育6 h内未发生任何降解。与人新鲜血清37℃孵育1、3和6 h后,99Tcm-hTERT ASON的血清蛋白结合率分别为15.0%±1.6%、18.0%±1.9%和20.0%±2.4%。99Tcm-hTERT ASON具有较高标记率、放射化学纯度和比活度;其放射稳定性和序列稳定性均良好,与血清蛋白结合率较低,适合作为反义显像剂用于进一步研究。

^(99)Tc^m标记反义miR208b寡核苷酸及其转染离体肥大心肌细胞的实验研究

目的探索用放射性核素99Tcm标记反义mi R208b寡核苷酸,并转染离体早期肥大心肌细胞的实验过程及方法。方法合成针对mi R208b的反义mi R寡核苷酸(AMO),LNA(带锁核酸)修饰AMO,将双功能螯合剂NHS-MAG3(N-羟基琥珀酰亚胺-巯基乙酰基三甘氨酸)与LNA-AMO偶联后,用99Tcm标记,然后用Sep-Pak C18反相层析法对NHS-MAG3-LNA-AMO及其标记物进行洗脱纯化,前者同时经Gene Quant DNA/RNA calculator测定在260 nm波长处的吸光度;不同检测方法测定纯化后标记物的标记率、放化纯度、稳定性以及与靶基因杂交的活性;建立由血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的离体心肌肥大细胞模型,检验早期肥大心肌细胞内mi RNA208b的相对表达量以及经脂质体包裹的99Tcm-NHS-MAG3-LNA-AMO在早期肥大心肌细胞内的滞留率。结果纯化后的标记物标记率>84%,放化纯度>86%,标记物分别在新鲜人血清、生理盐水中孵育12 h后,放化纯度均大于80%,并具有与靶向基因杂合的能力。离体心肌肥大模型成功建立,测得早期心肌肥大细胞内mi RNA208b表达升高,且最终标记物转染细胞后6 h滞留率大于20%。结论在双功能螯合剂NHS-MAG3以及LNA的介导下,成功将放射性核素99Tcm标记于NHSMAG3-LNA-AMO,最后将反义探针顺利转染早期离体肥大心肌细胞,这为后续的在体心肌肥大核素显像提供重要实验基础。