利用RNAi技术抑制拟南芥NHX1基因家族的表达

采用RNAi抑制NHX1基因家族的表达,并观察其对拟南芥耐盐性和耐旱性的影响.根据从拟南芥(Ara-bidopsis thaliana)cDNA中扩增出编码Na+/H+反向转运蛋白基因AtNHX1长度为210 bp高度保守序列作为RNAi的靶标区,并正反2个方向插入载体pHANNIBAL中,2个片段用intron连接;将RNAi表达框连入具有NPTⅡ筛选标记基因的表达载体pART27中,构建以拟南芥NHX1基因家族为靶标的RNAi载体.采用农杆菌介导的真空渗透法转化拟南芥,得到T0代转基因拟南芥种子.对转基因阳性植株进行RT-PCR检测以及耐盐性和耐旱性分析.结果表明,利用本实验构建的NHX1基因家族RNAi载体,拟南芥NHX1基因家族表达被成功地抑制;耐盐和耐旱分析表明RNAi技术对基因表达沉默是有效的.

互花米草NHX1基因的cDNA全长克隆、序列信息及定量表达分析

以盐生植物互花米草(Spartina alterniflora)为试验材料,利用RACE技术克隆到编码Na+/H+逆向转运蛋白的NHX1基因的cDNA全长序列。利用生物信息学软件及网站对获得的基因核苷酸序列及编码的蛋白质序列进行分析,结果发现该核苷酸序列长度为2 277 bp,开放阅读框为1 623 bp,编码540个氨基酸残基,且该基因所编码的蛋白质与植物的Na+/H+逆向转运蛋白NHX1同源,所以命名为SaNHX1基因。同时氨基酸序列比对显示,其与芦苇(Phragmites australis NHX,BAD95562.1)、玉米(Zea mays NHX,XP_008653443.1)、水稻(Oryza sativa NHX,BAA83337.1)等的NHX亲缘关系相近,同源相似性依次为94%、92%、91%。利用Qiagene Rotor Gene Q荧光实时定量PCR仪对不同时间盐处理及ABA处理的互花米草材料进行荧光定量PCR检测。结果发现,在盐处理及ABA处理的不同处理时期,该基因的相对表达量都发生了明显的变化,这表明该基因受到了盐胁迫及ABA胁迫的诱导,由此可以看出Sa NHX1基因与植物的耐盐性有着密切的关系。

珠美海棠Mz_2NHX1基因的克隆和序列分析

以珠美海棠幼苗根系的c DNA为模板,根据珠美海棠NHX1(GQ503257)的保守序列设计引物,通过RT-PCR扩增得到目的基因全长1 865 bp,包含1个1 635 bp的开放阅读框,编码544个氨基酸,其核苷酸序列与苹果(GU338395)、玫瑰(KC188664)、杨树(ACU01853)的核苷酸序列同源性分别是95%、93%、91%。其对应的氨基酸序列与拟南芥(AAF21755)、玫瑰(BAD93487.1)和大叶补血草(BAB11940)液泡型Na+/H+逆向转运蛋白的氨基酸序列的同源性分别是79%、87%、79%,说明该蛋白是一种定位于液泡膜的Na+/H+逆向转运蛋白,该基因属于液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因。它编码的蛋白质分子量为60.5 ku,理论等电点(p I)为8.85,二级结构主要由α-螺旋、β-折叠和不规则卷曲构成,其N-末端具有12个跨膜疏水片段,C-末端具有亲水的长链尾巴,在跨膜片段内含有氨基酸保守序列85-LFFIYLLPPI-94,是Na+/H+逆向转运蛋白抑制剂氨氯吡嗪咪的结合位点。

硅促进盐胁迫下黄瓜NHX1基因表达及Na^+在液泡中的区隔化效应

【目的】硅可提高植物的耐盐性,但不同植物中硅提高耐盐性的机理并不相同。探究硅对盐胁迫下黄瓜幼苗的氧化损伤、Na^+积累和激素水平的影响,以阐明硅提高黄瓜耐盐性的机制。【方法】以基因型为Mch-4的黄瓜幼苗为试材,进行水培试验。营养液中NaCl的胁迫浓度为65 mmol/L,施硅水平为Na2SiO3·9H2O0.3 mmol/L。在处理10天后,测定黄瓜幼苗生物量、Na^+含量与分配、Na^+转运相关基因表达水平及激素含量。【结果】施硅可改善盐胁迫下黄瓜幼苗的生长,减轻植株的氧化损伤。硅对盐胁迫下黄瓜根系和叶片Na^+含量无明显影响,可显著降低根和叶中质膜Na^+/H^+反向转运蛋白基因SOS1的表达量,对高亲和力钾转运蛋白基因HKT1的表达均影响不大,但促进了液泡膜Na^+/H^+反向转运蛋白基因NHX1的表达。对盐胁迫下黄瓜叶片Na^+的亚细胞定位发现,硅处理使叶绿体中Na^+含量下降,而液泡中Na^+含量升高。硅处理提高了盐胁迫植株根和叶片中赤霉素、生长素和细胞分裂素的水平。【结论】施硅可提高液泡膜Na^+/H^+反向转运蛋白基因NHX1的表达,将Na^+区隔化于液泡中,进而降低叶绿体中的Na^+含量,缓解盐胁迫下黄瓜幼苗的氧化损伤;硅还诱导产生了较多的赤霉素、生长素和细胞分裂素,其调控Na^+积累和黄瓜幼苗的氧化损伤的机理还需进一步研究。

转AtNHX1基因烟草钾积累及根系生理特性

为了探明转At NHX1基因提高烟叶钾含量的生理原因,利用大田和水培试验,以3个转At NHX1基因阳性纯合株系N7、N9和N10,以及未转化烟草K326(对照)为材料,研究了转At NHX1基因烟草钾含量、根系形态和生理特性。结果表明,转At NHX1基因烟草在大田中长势一致,烟叶含钾量在10~70 d叶龄始终显著高于对照;在水培实验中,转At NHX1基因烟草吸收K^+能力强,具有较大的K^+吸收速率,其根系形态、根系活力、阳离子交换量和ATPase活性均显著高于对照。转At NHX1基因烟草具有富钾基因型烟草钾高效吸收和积累的特征,因而钾含量大大提高。

角碱蓬NHX1基因的克隆及在烟草中的表达

Na+/H+逆向转运蛋白在植物抗盐碱的过程中起着至关重要的作用。本实验首次从角碱蓬中克隆出Na+/H+逆向转运蛋白基因NHX1,并将其连接到真核表达载体pBIGFP中,通过农杆菌LBA4404介导转化至烟草中。最后的分子检测实验结果表明,NHX1基因成功整合到了烟草的基因组中并得到了有效表达。

转Mz_2NHX_1基因拟南芥对盐胁迫的生理响应

为了探讨珠美海棠Na^+/H^+逆向转运蛋白基因Mz_2NHX_1在植物耐盐中的作用,以野生型拟南芥和转Mz_2NHX_1基因拟南芥为材料,研究不同盐浓度对转基因和野生型拟南芥种子萌发、植株耐盐性相关生理指标的影响。结果表明:在不同盐胁迫下,转基因拟南芥种子发芽率明显高于野生型。随着盐浓度的增加,野生型和转基因植株的电导率呈上升趋势;SOD活性呈先上升后下降趋势;POD活性、可溶性糖含量、脯氨酸含量在野生型植株中呈先上升后下降趋势,在转基因植株中呈不断升高的趋势。盐胁迫下,转基因植株的各项生理指标均优于野生型,表明Mz_2NHX_1基因的过量表达,提高了转基因拟南芥的耐盐性。

大叶补血草Na^+/H^+逆向转运蛋白基因的克隆及序列分析

根据同源序列区域设计简并引物,利用RT-PCR及RACE方法从盐生植物大叶补血草中分离了Na+/H+逆向运输蛋白基因的cDNA(LgNHX1,GenBank登录号EU780457)。LgNHX1的cDNA全长为2 397 bp,5′端非翻译区长度为512 bp,3′端非翻译区长度为229 bp,其中包括12 bp的poly(A)尾巴,中间的开放读码框为1 656bp,编码1个550个氨基酸的多肽,推测分子量为61 kD。氨基酸同源性分析表明,LgNHX1与北滨藜、小麦、盐角草和拟南芥液泡Na+/H+逆向运输蛋白的一致性分别为82.62%,82.01%,80.64%和75.86%。预测分析表明,LgNHX1具有11~12个跨膜结构区域。系统发育分析表明该蛋白(LgNHX1)与液泡型的Na+/H+逆向转运蛋白的亲缘关系较近,与质膜型的Na+/H+逆向转运蛋白亲缘关系较远。

红海榄液泡膜Na^+/H^+逆向转运蛋白基因的克隆与分析

根据液泡膜Na+/H+反转运蛋白基因(NHX1)的保守序列设计引物,通过RT-PCR扩增得到红海榄Na+/H+反转运蛋白基因的cDNA片段,然后采用cDNA末端快速扩增法(RACE)得到RsNHX1基因的全长cDNA序列,GenBank登录号为FJ627273,被命名为RsNHX1。该基因序列的长度为2 094 bp,包含有1个1 614 bp的开放阅读框,编码538个氨基酸。该基因生物信息学分析表明:其氨基酸序列与胡杨PeNHX1(ABY86892)和拟南芥AtNHX1(AAM34759)基因的同源性分别为74%和69%,序列存在较大差异。

根癌农杆菌介导的苜蓿悬浮胚性愈伤遗传转化体系的建立与优化

苜蓿基因型是限制遗传转化的关键因素之一。本实验通过对7种苜蓿胚性愈伤组织诱导,筛选出一份具有高频再生潜力的基因型公农-1号,并以该基因型为转化平台探索和建立了一套高效的苜蓿遗传转化系统。分析了影响农杆菌共培养转化苜蓿悬浮胚性愈伤的因素,优化了悬浮培养条件,建立的超声波辅助农杆菌介导苜蓿胚性愈伤的遗传转化系统为:以下胚轴诱导的愈伤组织经悬浮培养得到的胚性愈伤为转化材料,乙酰丁香酮为100μmol·L-1、超声波处理时间8s、卡那霉素筛选浓度30mg·L-1、共培养4d,接种于选择培养基上进行筛选和再生。最终,获得了大量的转基因植株,分子检测证实目的基因-角碱蓬液泡膜型Na+/H+逆向转运蛋白基因已经整合到苜蓿基因组中。