Breeding of NHase hyper-producing <i>Rhodococcus ruber</i>strain LUV_30-06and verification of mutants by RAPD

A nitrile hydratase (NHase) hyper-producing Rhodococcus ruber strain LUV30-06 was bred by mutagenization on the starting strain CGMCC3090 with ultraviolet irradiation and lithium chloride. The NHase activity of the strain LUV30-06 was increased by 21.99% (3881.3 U/ml), as compared with that of R. ruber CGMCC3090 (3181.4 U/ml). The mutant strain UV30-06 has been proved genetically stable with higher NHase activity in seven successive subcultures as well as random amplified polymorphic DNA analysis (RAPD).

我国生物法生产丙烯酰胺技术概论

丙烯酰胺(Acrylamide,简称AM)是丙烯酰胺系中最重要、最简单的一种,用途十分广泛,可用作有机合成及高分子材料的原料,主要用于生产有“百业助剂”“工业味精”和“万能产品”之称的聚丙烯酰胺。因此,研究当今第三代工业化生物法生产丙烯酰胺技术十分必要。本文首先介绍了丙烯酰胺工业化技术发展历程,其次陈述了我国生物法生产丙烯酰胺工业化技术,再次对我国生物法丙烯酰胺生产用腈水合酶的研究进行概述,最后提出当前我国生物法丙烯酰胺工业化生产中存在的主要问题。基于上述分析,展望今后国内生物法生产丙烯酰胺工业化技术的研究方向。

产腈水合酶重组大肠杆菌的质粒稳定性研究

成功构建了腈水合酶(nitrile hydratase,NHase)高表达的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pETNHM(Kanr),研究了重组质粒pETNHM在重组菌株中的质粒稳定性。结果表明,pETNHM具有较好的结构稳定性,连续传代60代后质粒的基因序列没有明显缺失,且能够正常表达腈水合酶。pETNHM具有分离不稳定性,在无抗生素选择压力下,连续传代48代后质粒丢失的无质粒细胞开始出现。琼脂糖凝胶电泳定量分析表明,2/3的质粒pETNHM以二聚体形式存在,导致质粒拷贝数的下降。进一步研究表明,重组细胞的连续高速分裂及腈水合酶的高表达也会造成质粒拷贝数的下降,从而降低其分离稳定性。反之,重组菌株相对于宿主菌株的较高比生长速率有利于保持含质粒细胞的生长优势,卡那霉素的选择压力则能够保证质粒的稳定遗传。

腈水合酶蛋白质纯化的研究进展

从产腈水合酶纯化的意义,腈水合酶的纯化步骤、策略、纯化产量和倍数以及RhodococcusruberCGMCC3090腈水合酶纯化的应用价值等,综述了腈水合酶纯化方面的研究进展.

红球菌菌株腈水合酶提取方法优化

研究了红球菌（Rhodoccus sp.Tccc28001）腈水合酶初步提取实验.对腈水合酶提取的菌体培养时间、细胞的超声破碎方法和硫酸铵分级分离方法进行了优化.结果表明,提取的最佳条件为：培养96 h收获菌体;在4℃下溶菌酶处理菌悬液40 h后进行超声波处理,400 W超声破碎60min,分2次进行,每次30 min（60个循环,15 s超声,15 s间歇）;然后使用40 mmol/L磷酸缓冲液,经20%~70%饱和度硫酸铵沉淀,能获得最高产率的腈水合酶.此研究为腈水合酶的层析纯化奠定了基础.

基于UC3875控制的高频谐振逆变电路

提出了一种以MOSFET为功率开关器件谐振电容分压输出高频逆变电路,分析了UC3875芯片移相控制的外围电路。文中还给出了一个60kHz逆变电路的仿真和实验波形,实验证明采用UC3875移相调压控制谐振电容分压输出的逆变电路是可行的。

铁型腈水合酶降解苯甲腈的分子模拟研究

为探索铁型腈水合酶降解腈的微观降解机制,文章用分子对接的方法模拟了铁型腈水合酶与腈的相互作用,得到它们复合物结构的理论模型,根据打分函数最低原则筛选出的铁型腈水合酶ReNHase与苯甲腈之间最佳构象打分函数为-64.881 5,二次打分函数为-56.663 1。并应用LPC/CSU server研究最佳构象的相互作用情况,结果表明,ReNHase与苯甲腈之间以疏水作用数量最多,ReNHase的PRO125 A、ILE24 B、LEU123 A和THR27 B在催化过程中起到了重要作用。

诺卡氏菌腈水合酶突变基因在重组大肠杆菌中的高活性表达

为了提高腈水合酶基因的重组表达水平,提出了3种基因策略:在重组大肠杆菌中共表达激活子序列、在重组毕赤酵母中表达以及对α亚基的起始密码子进行定点突变。结果表明:对α亚基的起始密码子进行定点突变的基因策略为最佳方案,突变后的腈水合酶基因在重组E.coli XL1-Blue(pUC18-NHBAM)中表达时,腈水合酶的比酶活(以干菌质量计)提高到51 U/mg。进一步以pET28a为载体,插入突变后的腈水合酶基因,构建重组菌株E.coli BL21(DE3)/pETNHM。对优选菌株进行培养条件和诱导条件的优化,腈水合酶的最高比酶活达到450 U/mg。

用于腈纶表面改性的Corynebacterium nitrilophilus腈水合酶的摇瓶发酵优化

通过毛细管效应、扫描电镜、染色实验等方法,考察了Corynebacterium nitrilophilus腈水合酶(nitrilre hydratase,NHase)在腈纶表面改性中的应用。结果表明,C.nitrilophilus腈水合酶处理后的腈纶纤维的润湿性及染料可染性分别比对照提高了43.5%和85.7%,说明该腈水合酶具有较好的腈纶纤维表面改性性能。为了提高用于腈纶表面改性的C.nitrilophilus腈水合酶的产量,采用单因素实验及正交实验在摇瓶上对碳源、氮源、诱导剂、金属离子等进行考察,获得较优的摇瓶发酵生产腈水合酶的条件:碳源采用葡萄糖,15 g/L;氮源采用酵母粉与氯化铵复配,浓度分别为3 g/L、1 g/L;诱导剂尿素的最适剂量为10 g/L;由于该腈水合酶是钴型酶,所以需在发酵过程中添加氯化钴,浓度为0.07 g/L。经过摇瓶优化,酶活由最初的16.2 U/ml提高到45.7 U/ml,提高了2.8倍。