Notch基因胞内活化部分真核表达载体p3XFLAG-CMV7-NICD1的构建与鉴定

目的构建Notch1基因胞内活化部分真核表达载体p3XFLAG-CMV7-NICD1,为进一步研究和解析Notch1基因在促进人晶状体上皮细胞间质化过程的作用做准备。方法从SRA01/04细胞中提取总RNA,RT-PCR法反转录合成c DNA。特异扩增目的基因片段NICD1,与p3XFLAG-CMV7载体连接后转化大肠杆菌DH5α,LB平板培养基筛选菌落,抽提质粒。并用酶切,测序,转染细胞后检测蛋白表达等方法验证。结果获得重组的p3XFLAG-CMV7-NICD1真核表达载体质粒,经双酶切及测序检测,NICD1基因插入载体部位正确,碱基序列正确。Western blot结果显示,在转染p3XFLAG-CMV7-NICD1的细胞中有NICD1蛋白的表达。结论 p3XFLAG-CMV7-NICD1真核表达载体质粒构建成功,为进一步研究Notch1传导通路与白内障摘除术后发生后囊膜混浊的关系奠定基础。

Notch1活性分子NICD1在乳腺癌变组织中的表达及临床意义

目的:探讨NICD1 m RNA在乳腺组织中的表达及与临床病理特征的关系,初步评价其在乳腺癌发生、发展中的作用及其意义。方法:应用实时定量PCR法检测25例乳腺正常组织、15例非典型导管增生、20例导管原位癌和80例乳腺浸润性导管癌中NICD1 m RNA表达,分析其与乳腺癌患者临床病理特征的关系。结果:NICD1m RNA从乳腺正常组织到浸润癌的癌变过程中的表达量呈显著递增趋势(P<0.001),其中在ANBT组中的表达显著低于DCIS和IDC组(0.70±0.32 VS 2.09±0.75,2.19±0.97;P<0.01),在ADH组的表达明显低于IDC组(1.05±0.44 VS 2.19±0.97;P<0.05),其余组间差异无统计学意义(P>0.05);NICD1m RNA表达与乳腺癌组织学分级、淋巴结转移状态及TNM分期显著相关(P<0.05)。结论:NICD1分子在乳腺癌发生过程中可能发挥促癌作用,有望作为评估乳腺癌变进展的潜在生物标志物。

Notch1(NICD)过表达真核载体构建及对大鼠BMSCs增殖分化的影响

目的探讨过表达Notch1(NICD)基因对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖分化的影响。方法构建Notch1(NICD)过表达真核载体,实验分正常对照组(CON组,不做转染)、阳性对照组(空载体组,将质粒pEGFP-N1转染BMSCs)和转染组(将重组质粒pEGFP-N1-NICD转染BMSCs)。转染48 h后观察细胞一般状态,Real-timePCR和Western blotting检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和Notch1基因和蛋白表达,流式检测转染后细胞凋亡、细胞周期,MTT检测细胞增殖情况。结果重组质粒pEGFP-N1-NICD编码序列与设计完全一致。转染组和空载体组BMSCs均可表达绿色荧光。转染组GFAP、Notch1的基因和蛋白表达均高于CON组和空载体组(均P<0.05),空载体组与CON组差异无统计学意义;各组间NSE的基因和蛋白表达差异无统计学意义。转染组存活细胞比率低于CON组和空载体组,早期细胞凋亡比率、晚期细胞凋亡比率均高于CON组和空载体组;空载体组晚期细胞凋亡比率高于CON组。转染组细胞处于G1/G0期的比例高于CON组和空载体组,处于S期和G2/M期的比例低于CON组和空载体组(均P<0.05)。除转染1 d时各组MTT A490值差异无统计学意义外,其余时点转染组MTT A490值均低于CON组和空载体组(均P<0.05)。结论高表达Notch1(NICD)基因可能在一定程度上诱导BMSCs凋亡、抑制其增殖,且表现诱导向神经胶质样细胞分化。