PGPR菌剂对攀西高原植烟土壤nifH基因群落的影响

为研究植物根际促生菌(PGPR)菌剂处理下攀西高原植烟土壤氮素循环的微生物调控机制,本研究以凉山州会理市不同PGPR菌剂(Lysinibacillus sp.、Streptomyces Phaeochromogenes和Aspergillus niger)处理下的植烟田为研究对象,采集烤烟成熟期根际土壤,通过化学分析和高通量测序技术对土壤理化性质、固氮酶活性及nifH基因群落组成及多样性进行分析。结果表明,与常规施肥相比,施用PGPR菌剂会显著降低植烟土壤的pH值,同时显著提高有效磷含量和固氮酶活性(P<0.05)。总体而言,施用PGPR菌剂提高了植烟土壤nifH基因群落的多样性。植烟土壤优势菌群为变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和蓝菌门(Cyanobacteria)。慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、地杆菌属(Geobacter)和固氮螺菌属(Azospirillum)等是植烟土壤优势属。冗余分析结果表明,植烟土壤pH值、碱解氮和速效钾含量与nifH基因群落结构相关性最强。综上,PGPR菌剂能改善植烟土壤养分状况,提高土壤固氮酶活性,影响植烟根际土壤nifH基因群落组成及多样性,其中以细菌PGPR菌剂Lysinibacillus sp.效果最佳。本研究结果为植烟土壤科学施肥、培肥地力提供了理论依据。

甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E nifH基因的克隆与序列分析(英文)

【目的】了解甘蔗内生固氮菌变栖克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）DX120E nif H基因的生物信息学,为揭示甘蔗内生固氮菌DX120E的固氮分子机理提供理论依据。【方法】根据NCBI上其他固氮菌株的nif H序列设计引物,对内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E菌进行PCR扩增;运用生物信息学方法对其核苷酸序列、编码的氨基酸序列进行分析,并对其蛋白结构进行预测。【结果】甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E nif H基因的ORF为882bp,Gen Bank登录号为KF732646.1,与Klebsiella pneumoniae 342、Klebsiella variicola At-22等6种固氮菌的nif H基因氨基酸序列同源性高达95.0%-99.0%。DX120E nifH蛋白与Klebsiella pneumoniae 342的亲缘关系最近,与非克雷伯氏菌固氮菌的亲缘关系较远。生物信息学分析显示,菌株DX120E的nif H基因编码293个氨基酸,起特别重要的氨基酸残基非常保守。该基因在N端有11个氨基酸残基即酪氨酸—甘氨酸—赖氨酸—甘氨酸—甘氨酸—异亮氨酸—甘氨酸—赖氨酸—丝氨酸—苏氨酸—苏氨酸,其属于典型结合ATP的基序结构。nif H蛋白分子量为32.07k D,pI为4.92,为酸性蛋白;其具有2个ASN糖基化位点,1个CAMP磷酸化位点,6个CK2磷酸化位点,6个PKC磷酸化位点。疏水性预测显示该蛋白为亲水性蛋白,无信号肽。【结论】变栖克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）DX120E nif H基因的推导氨基酸序列与克雷伯氏菌固氮菌属具有较高的同源性,该基因在甘蔗生物固氮过程中可能起重要作用。

耐除草剂转基因大豆对根际土壤固氮微生物nifH基因多样性的影响

通过大田试验,以两种耐除草剂转基因大豆(PAT、ALS)及相应非转基因亲本大豆(PAT1、ALS1)和当地主栽大豆中黄13(CK)为材料,采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术及扩增产物序列分析方法,探讨耐除草剂转基因大豆种植对根际土壤固氮微生物nifH基因多样性的影响。结果表明,PAT、ALS与相应亲本大豆PAT1、ALS1相比,根际土壤固氮微生物群落组成相似度均在60%左右。PAT、ALS根际土壤固氮微生物nifH基因多样性指数(H)和均匀度指数(EH)与相应亲本大豆相比差异均不显著(p>0.05)。测序结果表明,PAT、ALS与相应亲本大豆根际土壤中固氮微生物主要隶属于蓝藻门(Cyanobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)。不同处理下nifH基因与理化因子的典范对应分析结果表明,速效磷(AP)、硝态氮(NO3--N)对固氮微生物区系的影响达到显著水平(p<0.05)。以上结论表明,与PAT1、ALS1相比,两种耐除草剂转基因大豆对根际土壤固氮微生物nifH基因多样性的影响不显著。

氮对巨菌草内生固氮菌Klebsiella variicola GN02 nifH基因表达的影响

采用DNA电泳、qRT-PCR及Western blot技术分析了在无氮和含氮培养条件下,巨菌草内生固氮菌Klebsiella variicola GN02菌株nifH基因序列长度、基因与蛋白表达量的差异.结果表明,GN02菌株在无氮及含氮条件下均有nifH基因表达,其克隆得到的nifH基因与同属禾本科的甘蔗的nifH基因亲缘关系较近;无氮培养条件下nifH基因和蛋白表达量明显高于含氮条件下的表达量.表明无氮条件能诱导GN02菌株nifH基因表达量的增加,而氮源抑制nifH基因的表达.

巨菌草内生固氮菌Klebsiella variicola GN02 nifH基因的克隆及生物信息学分析

研究巨菌草(Pennisetum giganteum)内生固氮菌Klebsiella variicola GN02 nifH基因的生物学信息,对GN02菌株nifH基因进行克隆及完整性验证,并采用多种生物学在线软件对其进行生物信息学预测和分析。结果表明,GN02菌株nifH基因具有完整的ORF,长度882 bp,编码293个氨基酸,NCBI GenBank登录号为MK131264。生物信息学分析表明,GN02菌株nifH基因具有高度保守性,与其他物种来源的nifH基因核苷酸序列及氨基酸序列同源性均达到95%以上。nifH蛋白总相对分子量为31 970.73、理论等电点pI为4.72;跨膜模型倾向N-末端向外的由内到外的跨膜、整个多肽链表现为亲水性;有2个糖基化位点但无分泌信号肽,有可能存在螺旋卷曲结构;二级结构预测表明α-螺旋和无规则卷曲是其多肽链中的主要结构元件,延伸链散布于整个蛋白质中;在数据库中能对该蛋白进行三维同源建模。

氮肥对甘蔗叶片内生固氮菌nifH基因表达的影响

为了探究氮肥对甘蔗叶片内生固氮菌nifH基因表达的影响,从RNA和蛋白质水平,采用RT-PCR和Western blot等技术分析施氮和不施氮处理下3个甘蔗品种叶片中nifH基因表达的差异性及对固氮酶相对表达量的影响。结果表明,在大田生长的甘蔗,在施氮肥和对照处理的叶片内,都可检测到固氮菌nifH基因在基因水平和蛋白质水平的表达。施氮处理会抑制或降低叶片内固氮菌的nifH基因的表达,但有利于nifH在蛋白质水平的表达,3个甘蔗品种内生固氮菌nifH基因的相对表达量都是施氮处理下较高,尤其是甘蔗品种ROC22,处理与对照间达到了显著差异。

盐度对水稻土壤固氮微生物nifH基因多样性的影响

[目的]研究盐浓度对水稻土壤固氮微生物nifH基因多样性的影响。[方法]在不同盐浓度的土壤区域采集样品,提取土壤总DNA,采用末端限制性片段长度多样性分析技术(T-RFLP)对土壤固氮微生物nifH基因进行多样性分析。[结果]随着水稻土壤盐度上升,土壤有机质、全氮和碱解氮含量也呈现一定程度的上升趋势;水稻土壤nifH基因的分类操作单元(OTU)总数在土壤盐度最高时达最大值,各组优势细菌数量在2.5种左右,样本丰度主要集中在4个片段内,各组相对丰度差异不显著(P>0.05);水稻组土壤与富贵竹土壤相比,多样性和均匀度均差异显著(P<0.05),水稻各组间微生物多样性呈现盐度依赖效应,但差异不显著(P>0.05)。[结论]土壤盐度影响土壤性质及固氮微生物,微生物多样性呈现一定盐度依赖效应。

攀西高原不同轮作制度下土壤固氮微生物nifH基因多样性与群落结构特征

[背景]关于高原生境轮作制度对土壤固氮微生物群落组成及多样性的影响研究尚少。[目的]深入认识攀西高原不同轮作制度对农田土壤肥力及土壤固氮微生物nifH基因群落结构与多样性的影响,以期建立合理的轮作制度。[方法]以凉山州冕宁县不同作物轮作制度[包括光叶紫花苕-烤烟(分轮作15年和20年两种,分别为G1和G2)、苦荞-烤烟(KQ)、大麦-烤烟(DM)和撂荒(CK)]的土壤为研究对象,通过化学分析和Illumina MiSeq技术,对土壤理化性质、土壤固氮微生物nifH基因多样性及群落组成进行分析。[结果]撂荒土壤全氮、铵态氮、硝态氮、有机碳和含水量最显著(P<0.05)。KQ轮作下土壤有效磷和速效钾分别提高了43.0%和2.60%,而DM轮作下的土壤理化性质均下降。土壤固氮酶活以撂荒土壤最高,G2轮作最低。土壤固氮微生物nifH基因多样性以G1轮作最高、G2轮作最低,门水平上以变形菌门(Proteobacteria)是优势共有nifH基因类群,相对丰度占群落的63.0%-92.4%;属水平上,偶氮氢单胞菌属(Azohydromonas)是不同轮作制度下的优势物种,慢生根瘤属(Bradyrhizobium)是撂荒土壤中的优势物种。[结论]冗余分析发现,土壤pH和含水量是驱动土壤固氮微生物nifH基因的群落组成的关键因子。本研究表明不同轮作制度可以明显改变土壤肥力状况和固氮微生物nifH基因群落组成,其中以光叶紫花苕-烤烟轮作15年的影响最明显,可以提高土壤养分含量,增加土壤固氮微生物nifH基因多样性。

呼伦贝尔草原土壤固氮微生物nifH基因多样性与群落结构

采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术及扩增产物序列分析方法比较研究了呼伦贝尔5种草地类型(线叶菊草原、贝加尔针茅草原、羊草草原、大针茅草原、克氏针茅草原)土壤固氮微生物nifH基因多样性及群落结构特征。结果表明,不同草地类型间土壤固氮微生物群落组成差异显著,羊草草原和大针茅草原相似性较高,相似度为67%,而其他3个草地类型间相似性较低,相似度均低于60%。羊草草原土壤nifH基因多样性最高,其次是克氏针茅草原、大针茅草原和贝加尔针茅草原,线叶菊草原最低。系统发育分析结果表明,呼伦贝尔草原土壤固氮微生物大部分属于变形菌门的α-变形菌纲,分别隶属于慢生根瘤菌属、中慢生根瘤菌属、红假单胞菌属、固氮螺菌属。5种草地类型中,克氏针茅草原土壤中联合固氮菌和自生固氮菌居多,而其他4个草地类型均以共生固氮菌为优势生态类型。

nifH基因能够在高等植物叶绿体原核环境中表达

以高等模式植物烟草为材料，对固氮酶铁蛋白基因ｎｉｆＨ在叶绿体中的表达进行了研究．构建了ｎｉｆＨ基因叶绿体转化载体，并利用基因枪轰击法对烟草叶片进行了转化．基因枪轰击后，共获得６株壮观霉素抗性再生植株．ＰＣＲ检测及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定结果表明，ａａｄＡ和ｎｉｆＨ等外源基因已整合进入受体植物叶绿体基因组中； Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫沉淀法的测定结果则证明，ｎｉｆＨ基因能够在叶绿体原核环境中表达．

紫云英根瘤菌nifH基因的结构及其上游区重复顺序的存在

在自然界有为数众多的原核生物具有固定分子氮的能力。这个过程是由固氮酶复合物即组分Ⅰ(钼铁蛋白)和组分Ⅱ(铁蛋白)催化进行的。编码组分Ⅰ的基因称nifD、nifK,编码组分Ⅱ的基因称nifH。以肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumonioe)nifHDK作为探针与不同来源的自生或共生固氮菌的DNA杂交试验表明固氮酶结构基因具较高的同源性。

低能N^＋注入介导的沙漠寡营养细菌的nifH基因突变研究

在低能N+注入沙漠寡营养细菌DOB150菌株获得重组突变菌株DOB981的基础上,本研究应用生物信息学方法从DOB全基因组De novo数据中获得了nif H基因信息,分析结果表明重组突变菌株DOB981的2个拷贝nif H基因中分别有39个和5个碱基位点发生了突变。通过分析nifH基因的蛋白质二级结构,获得了蛋白质的结构域、功能位点、跨膜区域和卷曲螺旋等基本信息,为进一步理解低能离子注入介导的功能基因突变提供了分子证据。

新型氮肥对玉米根际土壤固氮微生物群落的影响

为探究长期施用新型氮肥对玉米连作体系根际土壤固氮微生物(nifH基因)群落的影响,采集长期定位试验(2014年始)玉米吐丝期根际土壤样品,以不施氮肥(N0)为对照,分析同常规尿素(CU)相比,3种新型氮肥[控释尿素(SU)、稳定性肥料(SF)、硫包衣尿素(SCU)]的施用对土壤固氮微生物群落的影响差异。结果表明:不施氮肥处理的固氮微生物nifH基因丰度高于施氮肥处理,不同氮肥处理中,稳定性肥料处理的固氮微生物nifH基因丰度(3.4×10^(6)copies·g^(-1))显著低于其他处理,pH(相对影响值为44.51%)和有机质(相对影响值为35.01%)是影响固氮微生物nifH基因丰度的主要因素。与不施氮肥相比,氮肥施用降低了固氮微生物nifH基因的丰富度及多样性,与常规尿素处理相比,新型氮肥提高了nifH基因的丰富度指数但降低了多样性指数。固氮微生物nifH基因属水平主导物种为Desulfovibrio(相对丰度为14.11%~33.39%)、Stenotrophomonas(相对丰度为2.66%~17.72%)和Bradyrhizobium(相对丰度为2.68%~6.32%)。是否施氮对土壤固氮微生物群落结构的变化有显著影响(P=0.001),但施用不同新型氮肥处理与常规尿素相比对群落结构变化无显著影响(P=0.1)。研究表明,施用新型氮肥提高了固氮微生物nifH基因丰富度,改变了固氮微生物的群落结构。

实时荧光定量PCR在固氮酶基因检测中的应用

实时荧光定量PCR是近年发展起来的一种新的实时定量检测特定核酸技术,它是核酸探针技术、荧光共振能量传递技术和PCR技术的有机结合。与常规PCR相比,它具有特异性更强、能有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,扩大了PCR的应用范围。概述实时荧光定量PCR技术在固氮酶(nifH)基因检测中的应用与研究进展,并探讨该技术的发展和应用前景。

黄土高原不同种植年限苜蓿土壤固氮微生物群落结构和丰度特征

生物固氮是紫花苜蓿(Medicago sativa)土壤氮素的重要来源,固氮微生物数量及其群落结构变化对土壤氮素供应和肥力维持起着重要作用。本研究采用Illumina MiSeq测序和荧光定量PCR技术,探究了黄绵土区玉米农田和不同种植年限[2019年(2年)、2012年(9年)、2003年(18年)]紫花苜蓿地土壤nifH固氮基因丰度、nifH固氮微生物群落结构和多样性,通过共现网络分析丰富和稀有固氮微生物的生态地位,耦合土壤理化性质明确影响固氮微生物群落结构的主导因子。结果表明,黄绵土固氮微生物nifH基因丰度为2.97×10^(6)~5.93×10^(6) copies·g^(-1)(干土),且表现为苜蓿地显著高于玉米农田。土壤样品经测序共获得有效序列176 367条,主要分布在5门、8纲、11目、15科、17属。门水平上,变形菌门和蓝藻门为主要优势类群;属水平以斯克尔曼氏菌属和固氮弧菌属为优势属。与玉米农田相比,多年持续种植紫花苜蓿显著提高了斯克尔曼氏菌属的相对丰度,但其随种植年限延长呈降低趋势。长期种植紫花苜蓿促生了固氮菌属、伯克氏菌属、弗兰克氏菌属、中慢生根瘤菌属、地杆菌属和慢生根瘤菌属等生理类群,同时也使得梭状杆菌属、红假单胞菌属和三离藻属消亡。RDA分析发现,固氮微生物不同种群对环境因子的响应并不一致,具有各自的生态位,但土壤全磷是影响土壤固氮微生物群落结构的主导环境因子,其次是有机碳和硝态氮。分子生态网络分析表明固氮菌生态网络中丰富类群占据生态系统核心地位,且物种间均为协同合作关系,群落结构相对稳定,对环境变化具有较强的适应能力。综上,黄土高原半干旱区种植紫花苜蓿显著提高了土壤nifH基因丰度,改变了固氮微生物nifH群落结构,该结果可为黄绵土固氮微生物多样性研究和紫花苜蓿适宜种植年限的确定提供基础数据和理论依据。

甘薯块根内生固氮菌的分离鉴定和系统发育分析

【目的】对甘薯块根内生固氮菌进行分子鉴定和多样性分析,并分析其菌群结构,为深入研究甘薯内生固氮菌的应用提供理论参考。【方法】以鄂薯11和鄂薯17为试验材料,采用无氮培养基筛选获得2个甘薯品种块根的内生固氮菌,根据16S rDNA基因序列分析对分离的内生固氮菌进行分类鉴定;进一步扩增nifH基因片段验证固氮菌;依据Shannon多样性指数、菌株相对分离率和相似性指数对甘薯块根内生固氮菌的菌群分布及多样性进行分析,并比较内生固氮菌菌群差异。【结果】从鄂薯11和鄂薯17块根中总共分离得到80株内生固氮菌,归属为1门1纲1目1科2属,包括普里斯特氏菌属(Priestia)和芽孢杆菌属(Bacillus),相对分离率分别为51.25%和48.75%;普里斯特氏菌属在鄂薯11和鄂薯17块根的相对分离率分别为51.11%和51.43%,芽孢杆菌属在鄂薯11和鄂薯17块根的相对分离率分别为48.89%和48.57%,2个甘薯品种块根中内生固氮菌的相对分离率变化差异小。2个甘薯品种块根内生固氮菌总Shannon指数为0.6929,总均匀度指数为0.4803。鄂薯11和鄂薯17间的相似性指数为1,2个甘薯品种块根中的内生固氮菌属相同。系统发育进化树显示,从鄂薯11和鄂薯17中分离得到的内生固氮菌遗传多样性较低。【结论】从鄂薯11和鄂薯17块根中分离鉴定出80株内生固氮菌,归属于普里斯特氏菌属和芽孢杆菌属,2个品种间的内生固氮菌菌群构成无明显差异。

库布齐沙漠不同演替阶段土壤结皮固氮菌群特征

运用nifH基因高通量测序及实时荧光定量PCR技术,分析库布齐沙漠演替初期物理结皮、演替中期藻类结皮、演替后期藓类结皮土壤固氮菌群组成、多样性及丰度;通过共现性网络及斯皮尔曼相关性分析关键类群及其对土壤理化因子的响应。结果表明,物理结皮、藻类结皮、藓类结皮土壤的优势固氮菌属皆为斯科曼氏球菌属(32.33%~50.72%);藻类结皮α多样性最低;藻类结皮、藓类结皮均与物理结皮间固氮菌群nifH基因丰度存在显著性差异(P<0.05);物理结皮与藻类结皮中关键固氮类群均为斯科曼氏球菌属,其丰度与土壤全磷含量呈显著负相关(P<0.05),而藓类结皮中关键固氮类群为固氮螺菌属,其丰度与速效氮含量呈显著正相关(P<0.05)。固氮菌群中斯科曼氏球菌属和固氮螺菌属分别是物理藻类结皮和藓类结皮的指示生物。

三江源地区不同植被土壤固氮微生物的群落结构研究

利用PCR_RFLP和测序分析法对位于青藏高原腹地三江源自然保护区的高寒草甸、高寒草原和高山森林等不同植被类型的土壤固氮微生物的群落组成进行了探讨。经过PCR_RFLP分析固氮基因nifH ,在3个样品中共得到2 33个克隆和99个可操作分类单元(OTUs) ,NQ_1样地具有最多的克隆数和OTUs,多样性为4 9 74 % ,在所有样品中分别具有1～2个明显的优势种群(占总克隆数>15 % ) ,并且具有4个共同的OTUs。选取了2 6个克隆进行基因测序分析,通过DNAMAN比较表明,这些序列间具有6 6 %～98%的相似性,并且在GenBank数据库中没有发现完全匹配的序列,因此这些序列可能代表着新的固氮生物株系。最后利用ClustalW与Mega软件构建了系统发育树,结果发现,这些序列被分为4个不同的簇,部分序列与属于蛋白细菌(Proteobacteria)的已知细菌具有近的亲缘关系,但是更多的序列与已知细菌具有较远的亲缘关系。

高寒地区不同退化草地植被特性和土壤固氮菌群特性及其相关性

选取东祁连山不同退化程度的高寒草地为研究对象,调查研究其植物种类、植被盖度、高度、地上生物量等植物指标以及土壤好气性自生固氮菌和嫌气性自生固氮菌数量,在此基础上,采用real-time PCR的方法扩增nifH基因,测定不同退化程度草地土壤中固氮菌相对于土壤总细菌的量,以探讨草地退化过程中植被及土壤固氮菌群的变化规律,结果发现:随着退化程度的加深,草地植物种类逐渐减少,并且优势植物发生变化,毒杂草逐渐增多,植被的高度、盖度、地上生物量都逐渐降低。对土壤固氮菌的研究则表明,土壤好气性自生固氮菌和嫌气性自生固氮菌的数量在不同退化草地随草地退化程度的加重而减少,在同一退化程度草地土壤则是随土层深度加深而下降。对土壤固氮菌nifH基因扩增的结果也表明随着退化加剧,土壤固氮菌相对于土壤总细菌的比例在降低,进一步说明草地退化过程中土壤固氮菌不仅是数量上的下降,更是群落结构层面的变化。对植被特性和土壤固氮菌含量的相关分析表明,植被特性和土壤中固氮菌含量呈显著相关。研究从土壤固氮菌群的角度研究了草地退化的过程,说明了二者具有协同性,研究和治理草地退化必须重视土壤功能菌群尤其是固氮菌群的作用。

长期有机污水灌溉对土壤固氮细菌种群的影响

固氮细菌是土壤生态系统中十分重要的功能群之一,在土壤氮素循环中发挥着不可替代的作用。本文通过传统培养方法和固氮基因(nifH)PCR-DGGE指纹图谱分析方法,从微生物功能群角度,研究了长期有机污水灌溉对土壤表层和亚表层固氮细菌种群数量和多样性的影响。结果表明,土壤表层固氮细菌数量随土壤污染的增高而不同程度减少,亚表层自生固氮菌数量无明显变化。从DGGE指纹图谱结果来看,对照清洁土壤的固氮细菌种群多样性较丰富,其Shannon指数在表层为2.4674,在亚表层为2.8210,分别高于受有机污水灌溉不同年限的土壤固氮细菌种群shannon指数,且种群的相似程度有所差异,说明种群结构发生了一定的变化。改清灌3a和改清灌30a土壤固氮细菌种群shannon指数分别略有增加,但种群结构并没有得到完全恢复。污水灌溉对土壤固氮细菌种群的影响具有长期的生态效应,是导致土壤生态与结构功能改变的重要因素之一。