去甲基化处理对NK-92MI细胞系抑制性受体KIR表达的影响

为分析NK细胞系NK-92MI细胞中抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immnoglobulin-like re-ceptor,KIR)的基因启动子区的甲基化模式及去甲基化处理对基因表达的影响,探讨基因kir可能的表达调控机制,采用亚硫酸氢盐测序法检测NK-92MI细胞kir2DL1和kir2DL2/2DL3基因启动子区的甲基化水平,应用甲基化抑制剂5-氮胞苷处理NK-92MI细胞以诱导CpG岛去甲基化,RT-PCR方法检测其基因表达。结果显示:kir2DL1和kir2DL2/2DL3基因启动子区CpG二核苷酸甲基化频率依次在25%-88%、5%-80%之间;应用甲基化抑制剂5-氮胞苷可以诱导NK-92MI细胞重新表达kir2DL1基因,并使kir2DL1、kir2DL2和kir2DL3基因表达量增加。结论:启动子甲基化参与调控NK-92MI细胞基因kir表达。

紫杉醇对NK-92MI细胞杀伤功能及凋亡的影响

探讨紫杉醇对人自然杀伤细胞系NK-92MI细胞株杀伤活性及凋亡的影响。用不同浓度的紫杉醇处理NK.92MI细胞后,测定NK-92MI细胞的增殖率和对靶细胞的杀伤作用;同时检测NK·92MI细胞凋亡率及凋亡相关基因Bcl-2、Ba】【的表达。结果表明,紫杉醇可以抑制NK-92MI细胞增殖并且降低其杀伤活性,机制可能是通过诱导NK.92MI细胞的凋亡,而后者与Bcll2/Ba】【基因表达增高有关。

去甲基化处理对NK-92MI细胞杀伤活力的影响

为观察DNA去甲基化处理对NK细胞系NK-92MI细胞抑制性KIR表达及细胞杀伤活力的影响,探讨抑制性kir基因去甲基化与NK细胞功能之间的可能联系,采用甲基化抑制剂5-氮胞苷处理NK-92MI细胞,采用流式细胞术检测NK-92MI细胞表面KIR3DL1、KIR2DL2/KIR2DL3、KIR2DL1表达及细胞活力,并采用流式细胞仪将NK-92MI细胞分选为KIR3DL1阳性和KIR3DL1阴性细胞群,采用乳酸脱氢酶释放法检测NK-92MI细胞对白血病细胞系K562的杀伤活力。结果显示:应用终浓度为1.0、2.5和5μmol/L的5-氮胞苷作用72小时可以诱导NK-92MI细胞KIR3DL1、KIR2DL2/KIR2DL3、KIR2DL1表达增加,同时NK-92MI对K562细胞的杀伤活力降低,5-氮胞苷在1-5μmol/L范围内不影响NK-92MI的细胞活力,KIR3DL1阳性NK-92MI细胞的杀伤活力较KIR3DL1阴性细胞的杀伤活力低。结论:去甲基化处理通过诱导抑制性KIR表达增加抑制NK-92MI细胞的杀伤活力。

低浓度紫杉醇对NK-92MI细胞增殖及细胞毒效应的影响

目的 探讨低浓度肿瘤化疗药物紫杉醇对人恶性非霍奇金淋巴瘤患者的自然杀伤细胞（NK-92MI）细胞系生长及细胞毒效应的影响.方法 体外培养NK-92MI,加入不同浓度（1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03、0.015、0.008、0.004μmol/L）的紫杉醇培养72h,MTS法检测NK-92MI细胞的增殖;以低浓度（0.02μmol/L）的紫杉醇预培养NK-92MI细胞48h,杀伤试剂盒检测NK-92MI 细胞对K-562细胞的细胞毒效应,流式细胞术检测NK-92MI细胞表面NKG2D受体的表达,RT-PCR检测NK-92MI受体NKG2D、NKG2A/B以及效应分子颗粒酶、穿孔素及IFN-γ基因的表达,ELISA检测IFN-γ分泌的改变.结果 高浓度（0.06～1μmol/L）紫杉醇明显抑制细胞的生长（P＜0.05）,且呈浓度梯度依赖性;低浓度（0.008～0.06μmol/L）紫杉醇能相对促进NK-92MI细胞的增殖,但无统计学意义（P＞0.05）,当低于0.008μmol/L时,对NK-92MI细胞的增殖不影响（P＞0.05）.0.02μmol/L紫杉醇能增强NK-92MI细胞的细胞毒活性,在效靶比为10∶1、5∶1、2.5∶1、1.25∶1时,实验组细胞毒效应均明显高于对照组（P＜0.05或0.01）.紫杉醇处理组NK-92MI细胞高表达穿孔素、颗粒酶及IFN-γ（均P＜0.05）,而抑制性受体NKG2A/B基因表达下调（P＜0.05）,未发现表面杀伤性受体NKG2D基因和蛋白的表达上调（P ＞0.05）.结论 低浓度紫杉醇能促进NK-92MI细胞的增殖和细胞毒活性,细胞毒活性的增强可能与紫杉醇处理后NK-92MI细胞活化能力增强以及相关基因（穿孔素和颗粒酶）的表达增强有关.

地塞米松诱导NK-92MI细胞株凋亡机制的研究

目的:探讨地塞米松(DEX)对NK-92MI细胞株杀伤活性及凋亡的影响及机制。方法:用不同浓度的DEX处理NK-92MI细胞:采用MTT比色法测定NK-92MI细胞的增殖率和对靶细胞的杀伤作用;流式细胞术检测NK-92MI细胞凋亡率;RT-PCR检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达。结果:浓度为1×10-8mol/L至1×10-3mol/L的DEX作用NK-92MI细胞24、48、72小时后,对其增殖均有明显抑制作用(P<0.05);效靶比为5∶1时,1×10-8mol/L至1×10-3mol/L的DEX对NK-92MI细胞杀伤活性均有抑制作用,与对照组相比有显著性差异(P<0.05);DEX可诱导NK-92MI细胞发生凋亡且凋亡诱导作用呈浓度时间依赖性;与对照组相比,DEX组Bcl-2基因表达降低(P<0.05),Bax基因表达增高(P<0.01)。结论:DEX可以抑制NK-92MI细胞增殖并且降低其杀伤活性,机制可能是通过诱导NK-92MI细胞凋亡,而后者与Bax/Bcl-2基因表达增高有关。

RhIL-21对NK-92MI细胞生物学活性的影响

目的探讨rhIL-21对NK-92MI细胞免疫功能的影响。方法以不同浓度(25～100ng/ml)的rhIL-21培养NK-92MI细胞24～72h,观察NK-92MI细胞的增殖。以50ng/ml的rhIL-21处理NK-92MI不同时间后,FACS检测NK-92MI细胞的凋亡,NK-92MI细胞表面NKG2D受体及胞内颗粒酶-B蛋白的表达;细胞杀伤试剂盒检测NK-92MI细胞对靶细胞K-562的细胞毒效应;RT-PCR检测NK-92MI受体NKG2D,效应分子颗粒酶-B、穿孔素及细胞因子IFN-γ基因mRNA的表达;ELISA检测其分泌IFN-γ的水平。结果 RhIL-21虽能抑制NK-92 MI细胞的增殖(P<0.05),但不会促进细胞的凋亡(P<0.05)。RhIL-21能促进NK-92MI细胞穿孔素、IFN-γ、颗粒酶-B、NKG2D受体基因及相应蛋白质的表达上调(P<0.05)。rhIL-21预处理组NK-92MI对K-562细胞的细胞毒效应也明显增强(P<0.05)。结论 RhIL-21能增强NK-92 MI细胞的细胞毒效应,IL-21在肿瘤的免疫治疗中有潜在临床应用价值。

嵌合抗原受体修饰的NK-92MI细胞对HER2阳性乳腺癌细胞的杀伤

目的:探讨用特异性靶向HER2抗原的嵌合抗原受体(HER2-CAR)修饰的NK-92MI细胞对HER2阳性乳腺癌细胞的杀伤效率。方法:通过PCR获得HER2-CAR片段,运用常规分子克隆技术,将其构建到慢病毒载体上,利用包装的慢病毒颗粒对NK-92MI细胞进行转染;应用流式细胞术检测细胞转染效率以及转染前后NK-92MI的IFN-γ和颗粒酶分泌差异;使用7-AAD和流式细胞术体外检测HER2-CAR-NK92MI细胞对乳腺癌细胞的杀伤效率;构建小鼠乳腺癌原位肿瘤模型进行体内细胞毒性的检测。结果:用HER2-CAR修饰的NK-92MI细胞对HER2阳性乳腺癌肿瘤细胞MCF-7和T47D的杀伤效率明显高于未被基因修饰的NK-92MI细胞[分别为(62.4±1.3)%vs(22.1±1.2)%和(50.0±1.9)%vs(16.9±0.6)%,P<0.01];而两者对HER2阴性的乳腺癌细胞MDA-MB-468的杀伤效率没有明显差异[(13.6±1.4)%vs(12.7±0.8)%,P>0.05]。同时,经HER2-CAR修饰的NK-92MI细胞相比未被基因修饰的NK-92MI细胞,IFN-γ的分泌明显升高(P<0.01)。结论:经HER2-CAR修饰的NK-92MI细胞对HER2阳性乳腺癌细胞的杀伤效率明显提高,且具有特异性靶向,此为治疗乳腺癌等恶性肿瘤提供了临床依据。

氧化苦参碱提高乳腺癌MCF-7细胞对NK-92MI细胞杀伤作用的敏感性

目的:探讨氧化苦参碱(OMT)处理前后MCF-7细胞对NK-92MI细胞敏感性的变化及其分子机制。方法:采用CCK-8法检测OMT对MCF-7细胞的毒性作用,采用LDH法和流式细胞术检测NK-92MI细胞对OMT处理后MCF-7细胞的杀伤活性,采用流式细胞术检测OMT处理后MCF-7细胞表面ULBP1、ULBP2和MICA/B蛋白的表达,采用Western blot法检测MCF-7细胞中p65蛋白的磷酸化水平,采用ELISA法检测培养液上清中TNF-α和IFN-γ的含量。结果:OMT对乳腺癌MCF-7细胞活力具有显著的抑制作用,且呈剂量和时间依赖性(P<0. 05);在不同效靶比(5∶1、10∶1和20∶1)下,低浓度OMT可显著提高MCF-7细胞对NK-92MI细胞杀伤作用的敏感性(P<0. 05);低浓度OMT处理后的MCF-7细胞,ULBP1、ULBP2和MICA/B蛋白的表达水平以及p65蛋白的磷酸化水平都显著上调(P<0. 05),可促进NK-92MI细胞分泌更多的TNF-α和IFN-γ(P<0. 05),但该作用可被NF-κB抑制剂PDTC抑制(P<0. 05)。结论:低浓度OMT在体外提高乳腺癌MCF-7细胞对NK-92MI细胞杀伤作用的敏感性,这可能与其激活NF-κB信号通路有关,进而上调MCF-7细胞表面ULBP1、ULBP2和MICA/B蛋白表达,以及促进NK-92MI细胞分泌TNF-α和IFN-γ有关。

靶向CD7的嵌合抗原受体NK-92MI细胞对CD7阳性血液系统恶性肿瘤细胞的杀伤作用

目的:探讨特异性靶向CD7分子的嵌合抗原受体(CD7-CAR)修饰的NK-92MI细胞对CD7阳性血液系统恶性肿瘤细胞的杀伤作用。方法:分别收集5例CD7^+的急性T淋巴细胞白血病(acute T-lymphoblastic leukemia,T-ALL)、10例急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)和6例T细胞淋巴瘤三类血液系统恶性肿瘤细胞,经实验室离心处理、培养后检测肿瘤细胞表面靶标的表达水平;应用7-AAD、CD56-APC、CD3-FITC、IgG Fc-PE流式细胞术检测NK-92MI和CD7-CAR-NK-92MI细胞的转染效率;使用PE Annexin V Apoptosis Detection Kit检测CD7-CAR-NK-92MI细胞对CD7阳性血液肿瘤细胞的体外杀伤效率。用CBA试剂盒检测杀伤后NK-92MI和CD7-CAR-NK-92MI细胞因子白介素-2(IL-2)、干扰素(IFN-γ)及颗粒酶B的分泌差异。结果:CD7-CAR修饰的NK-92MI细胞对CD7^+T-ALL、AML、T细胞淋巴瘤肿瘤细胞的杀伤效率明显高于未被修饰的阴性对照组NK-92MI细胞,其差异具有统计学意义(P<0.05);与未被修饰的NK-92MI细胞相比,经CD7-CAR修饰的NK-92MI细胞分泌的细胞因子中,IFN-γ和颗粒酶B的水平明显升高(P<0.05)。结论:经CD7-CAR修饰的NK-92MI细胞对CD7^+T-ALL、AML和T淋巴瘤细胞的杀伤效率显著提高,且具有特异性靶向作用。

靶向CD19抗原的CAR-NK-92MI和CAR-CD19-T细胞对套细胞淋巴瘤的体外杀伤

目的:探讨靶向CD19抗原的CAR-NK-92MI和CAR-CD19-T细胞对套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma,MCL)的体外杀伤作用。方法:利用近年来在B细胞急性淋巴细胞白血病(B-lineage acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)临床试验中获得的成功嵌合抗原受体基因修饰的T(CAR-T细胞)技术,针对MCL高表达CD19抗原的情况,分别构建了靶向CD19抗原的CAR-CD19-T和CAR-NK-92MI细胞,运用LDH释放法检测两者对MCL细胞的体外杀伤作用,另外通过流式细胞术对其杀伤作用进行了验证。结果:相对于对照,无论是CAR-NK-92MI细胞还是CAR-CD19-T细胞,都对MCL细胞具有极高的杀伤能力(均P<0.01),都对K562-CD19细胞具有非常高的毒性(均P<0.01),而对K562细胞基本不起作用。CAR-NK-92MI细胞组MCL细胞的死亡率比对照组高30%~40%,CAR-CD19-T细胞组MCL细胞的死亡率比对照组高40%~50%。结论:CAR-NK-92MI和CARCD19-T细胞在体外对MCL细胞具有强的特异性杀伤作用。

IL-7和IL-21修饰的NK-92MI细胞对其自身及正常人外周血T细胞的影响

目的:研究经IL-7和IL-21修饰后的NK-92MI细胞的增殖和细胞毒性及其对正常人外周血中T细胞的影响。方法:通过基因工程将IL-7和IL-21基因片段构建到电转载体上,通过电转的方式构建了NK-92MI/IL-21和NK-92MI/IL-7&21细胞。以细胞计数法和CFSE/7-AAD流式术分别对NK-92MI、NK-92MI/IL-21和NK-92MI/IL-7&21细胞体外增殖活性和细胞毒性进行比较。将正常人PBMC与NK-92MI、NK-92MI/IL-21和NK-92MI/IL-7&21细胞体外共培养后,用流式细胞术检测PBMC中T细胞的表型变化;同时检测正常人活化后的T细胞与NK-92MI、NK-92MI/IL-21和NK-92MI/IL-7&21细胞共存时相互的细胞毒性以及对肿瘤细胞的毒性比较。结果:成功构建了高表达IL-21的NK-92MI/IL-21细胞和同时高表达IL-7和IL-21的NK-92MI/IL-7&21细胞;NK-92MI、NK-92MI/IL-21和NK-92MI/IL-7&21细胞对Jurkat和K562细胞的细胞毒性没有变化,但是NK-92MI/IL-21和NK-92MI/IL-7&21细胞相对于亲本细胞NK-92MI的体外增殖活性有所提高;NK-92MI/IL-21和NK-92MI/IL-7&21细胞对PBMC中T细胞的活化有一定的促进作用;活化后的T细胞与NK-92MI、NK-92MI/IL-21和NK-92MI/IL-7&21细胞相互之间几乎无细胞毒性;同时,当T细胞和3种NK细胞共存时,T细胞不影响NK细胞对K562细胞的细胞毒性。结论:基因工程修饰的NK-92MI/IL-21和NK-92MI/IL-7&21细胞体外增殖活性有所提高,它们对外周血T细胞的活化有一定的刺激和促进作用;T细胞和NK-92MI细胞之间无细胞毒性,同时活化T细胞的存在不影响NK-92MI细胞的细胞毒性。

基于细胞糖链工程的尼妥珠单抗-NK细胞偶联物的构建及其活性研究

目的 通过基于唾液酸酶-糖基转移酶的细胞糖链工程构建偶联高密度的尼妥珠单抗的NK-92MI细胞,并评价其对肿瘤细胞的靶向和杀伤效果。方法 首先通过化学酶法和点击化学制备含有四嗪标签的GDP-岩藻糖,并探索制备含有反式环辛烯标签的尼妥珠单抗,再利用反式环辛烯-四嗪点击化学构建GDP-岩藻糖-尼妥珠单抗偶联物(GF-Nimo)。然后利用α1,3岩藻糖基转移酶将GF-Nimo转移至经唾液酸酶处理过的NK-92MI细胞表面,构建尼妥珠单抗-NK细胞偶联物,并通过流式细胞术和共聚焦成像实验验证偶联效果。最后以人结肠腺癌SW480为靶细胞,通过乳酸脱氢酶细胞毒性检测评价抗体-细胞偶联物的肿瘤细胞杀伤效果。结果首次成功将基于唾液酸酶-糖基转移酶的偶联方法应用于NK-92MI细胞,成功制备尼妥珠单抗-NK-92MI细胞偶联物。相比之前的基于岩藻基糖转移酶的方法,构建的抗体-细胞偶联物抗体偶联密度更高,具备更好的EGFR+细胞靶向性和更强的细胞杀伤作用。结论 构建抗体药物偶联NK细胞为尼妥珠单抗的拓展应用提供了新的途径,基于唾液酸酶-糖基转移酶的偶联方法学为后续开发阶梯式抗体与海洋糖类药物双分子细胞偶联方法奠定了基础。

氢化可的松对NK-92MI细胞杀伤活性及凋亡的影响

为了探讨氢化可的松(hydrocortisone,HC)对NK-92MI细胞株杀伤活性及凋亡的影响,用不同浓度的HC处理NK-92MI细胞;采用MTT比色法测定NK-92MI细胞的增殖率和对靶细胞的杀伤作用;流式细胞术检测NK-92MI细胞凋亡率;RT-PCR检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达。结果显示,作用NK-92MI细胞24、48、72 h后,7.5μg/dl和15μg/dl的HC对其增殖无明显抑制作用(P>0.05),30μg/dl、60μg/dl、120μg/dl、240μg/dl的HC对其增殖均有明显抑制作用(P<0.05),且呈浓度时间依赖性;效靶比为5∶1时,7.5μg/dl和15μg/dl的HC对NK-92MI细胞杀伤活性无显著影响(P>0.05),30μg/dl、60μg/dl、120μg/dl、240μg/dl的HC对其杀伤活性抑制作用显著(P<0.05),呈浓度依赖性;60μg/dl、240μg/dl的HC可诱导NK-92MI细胞发生凋亡;与对照组相比,60μg/dl HC 24 h组Bcl-2基因表达降低(P<0.05),Bax基因表达增高(P<0.01)。提示,应激浓度的HC可以抑制NK-92MI细胞增殖并且降低其杀伤活性,机制可能是通过诱导NK-92MI细胞凋亡,而后者与Bax/Bcl-2基因表达增高有关。

益艾康含药血清对人NK-92MI细胞增殖及其效应分子颗粒酶穿孔素基因表达的影响

目的探讨益艾康含药血清对人自然杀伤细胞增殖及其效应分子颗粒酶、穿孔素基因表达的影响。方法培养人NK-92MI细胞系,设空白对照组,4﹪、8﹪、10﹪、15﹪含药血清组,48h后分别加入空白鼠血清及不同浓度的益艾康含药血清,继续培养6h后观测NK-92MI细胞数量变化、增殖及对其靶细胞K562的细胞毒效应;Real Time PCR检测NK细胞效应分子颗粒酶、穿孔素基因的表达。结果与空白对照组相比,不同浓度的益艾康含药血清均能够促进NK-92MI细胞增殖,8﹪、10﹪益艾康含药血清组NK-92MI细胞的细胞毒效应明显高于空白对照组(P﹤0.05);2-△△Ct法分析表明8﹪益艾康含药血清能明显上调NK-92MI细胞颗粒酶基因的表达。结论益艾康含药血清能显著促进NK-92MI细胞增殖,增强NK-92MI细胞毒功能,其机制可能与上调颗粒酶基因的表达有关。

益艾康含药血清对人NK-92MI细胞凋亡及其受体NKG2A、NKG2D、细胞因子IFN-γ表达的影响

目的:探讨益艾康含药血清对NK-92MI细胞凋亡及其受体NKG2A、NKG2D,细胞因子γ干扰素(IFN-γ)表达的影响。方法:利用细胞系NK-92MI为研究对象,设4%、8%、15%、25%含药血清及空白对照组,培养48h后分别加入空白鼠血清及不同浓度的益艾康含药血清,再培养6h后收集细胞。流式细胞术检测细胞凋亡率及NKG2A、NKG2D膜抗体的表达;ELISA检测NK-92MI细胞IFN-γ分泌的改变;Real-Time PCR检测细胞NKG2A、NKG2D、IFN-γ mRNA的表达。结果:与空白对照组比较,8%益艾康含药血清组能显著下调NK-92MI细胞NKG2A mRNA的表达(P<0.05);也能显著促进其细胞因子IFN-γ的分泌(P<0.05),8%含药血清组能显著抑制NK-92MI细胞早期凋亡率(P<0.05),15%含药血清组能显著抑制NK-92MI细胞晚期凋亡率(P<0.05)。结论:益艾康含药血清增强NK-92MI细胞毒功能的机制可能与抑制NK细胞凋亡,下调其抑制性受体NKG2A表达,促进IFN-γ分泌有关。

靶向CD19的CAR修饰的NK细胞对B细胞淋巴瘤的杀伤

目的:利用鼠杂交瘤技术筛选和制备治疗性CD19单克隆抗体,探讨以CD19 scFv序列构建CD19-CAR(p CD19-CAR)修饰的NK细胞对CD19^+B细胞淋巴瘤细胞的杀伤作用。方法 :用偶联多肽免疫小鼠制备CD19单克隆抗体,然后用基因测序法获得抗体的序列。分析抗体序列,并通过基因合成和分子克隆技术构建pCD19-CAR片段,然后将其克隆到慢病毒载体上,病毒包装制备后,转染NK-92MI细胞。最后,用流式细胞术检测不同的pCD9-CAR-NK-92MI细胞对CD19^+细胞的杀伤率。结果:(1)成功筛出特异性强的CD19单克隆抗体-pCD19;(2)抗体检测结果显示CD19+的Ramos细胞的阳性率为84.3%,Raji为85.6%,与商业化抗体结果相似;(3)被pCD19-CAR修饰的CD19-CAR阳性率为28.72%的NK-92MI细胞对CD19^+的Ramos和Raji细胞的杀伤效率明显高于未被修饰的NK-92MI细胞株对Ramos和Raji细胞的杀伤率[(47.1±1.7)%vs(24.7±6.2)%和(51.8±7.9)%vs(27.6±9.6)%,均P<0.05];对CD19-细胞Jurkat,不论是未被pCD19-CAR修饰的NK-92MI或是被修饰的NK-92MI细胞,几乎都不存在特异性杀伤作用[(16.1±0.7)%vs(17.7±2.9)%,P>0.05]。结论:成功构建pCD19-CAR,被pCD19-CAR修饰的NK-92MI细胞能特异性的识别CD19抗原并杀伤CD19^+B细胞淋巴瘤细胞。