杀伤细胞凝集素样受体亚家族G成员1在慢性乙型肝炎病毒感染中对自然杀伤细胞功能的影响

目的研究慢l生乙型肝炎病毒（HBV）感染中的杀伤细胞凝集素样受体亚家族G成员1（KLRG1）表达对自然杀伤（NK）细胞功能的影响。方法提取120例慢性乙型肝炎病毒感染者和19名健康对照外周血单个核细胞（PBMC），使用流式细胞仪检测外周血中NK细胞和KLRG1^＋NK细胞频数，检测外周血PBMC中分泌干扰素Y的NK细胞频数，并用GraphPad Prism6．03软件对实验数据进行统计分析。结果HBV感染组NK细胞频数（16．92％±7．9％）与健康对照组（10．57％±6．5％）比较，差异无统计学意义；HBV感染组KLRG1^＋NK细胞频数（49．43％±21．2％）明显高于健康对照组（31．60％±17．9％），差异有统计学意义（t=7．3476，P〈0．001）；HBV感染组分泌干扰素v的KLRG1^＋NK细胞频数（2．59％±1．0％）明显低于健康对照组（5．96％±2．4％），差异有统计学意义（P=0．009）。结论HBV感染可增加NK细胞KLRG1的表达，并且进一步减少NK细胞中干扰素γ分泌，可能是造成HBV慢性感染的重要因素。

原发性胆汁性胆管炎患者肝组织中自然杀伤细胞活化性受体及其配体的表达及意义

目的探讨原发性胆汁性胆管炎(PBC)中NK细胞活化性受体(NKG2D)及其配体(MICA)、相关细胞因子(IFNγ、IL-10、IL-15)表达与肝内炎症的关系。方法选取2014年8月-2015年6月在昆明医科大学第二附属医院住院且确诊为PBC(PBC组,n=30)、慢性乙型肝炎(CHB组,n=15)和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD组,n=10)患者的肝穿刺活检标本。判断肝脏标本的肝脏炎症活动度(G)和纤维化程度(S),采用免疫组化法分别观察3组肝组织中NKG2D、MICA、IFNγ、IL-10、IL-15的表达情况(根据染色细胞多少及染色深浅计算染色评分,判断各指标表达情况)。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用t检验,相关性分析采用Spearman分析。结果 PBC组NKG2D的表达随炎症程度加重而上升,G3~4级者明显高于G1~2级者(G1vs G2 vs G3 vs G4:1.4±0.05 vs 1.56±0.05 vs 1.86±0.11 vs 2.60±0.17,F=150.8,P <0.05);随纤维化程度加重而下降(S3 vs S4:2.30±0.17 vs 1.56±0.05,t=-1.52,P <0.05)。PBC组G3与G4级MICA比较差异无统计学意义(0.11±0.01 vs 0.20±0.03,t=-2.20,P> 0.05),S3与S4级比较差异无统计学意义(0.12±0.02 vs 0.18±0.03,t=-2.64,P> 0.05)。PBC组IL-15在炎症程度组间比较差异有统计学意义(G1 vs G2 vs G3 vs G4:0.70±0.10 vs 1.50±0.10 vs 1.93±0.11 vs 2.60±0.17,F=251.3,P <0.05),在纤维化程度组间比较差异无统计学意义(S3 vs S4:2.00±0.05 vs 2.40±0.30,t=-1.62,P> 0.05)。CHB组IL-15的表达在不同炎症程度组间比较差异有统计学意义(G1 vs G2 vs G3:0.73±0.15 vs 1.96±0.15 vs 2.50±0.17,F=150,P <0.05),在不同纤维化程度组间比较差异有统计学意义(S1 vs S2 vs S3:0.70±0.10 vs 21.96±0.15 vs 2.50±0.17,F=158.7,P <0.05)。PBC组IL-10仅G1期表达(0.16±0.01),CHB组G1、G2级均表达IL-10,且差异无统计学意义(G1 vs G2:0.19±0.01 vs 0.13±0.01,t=-1.522,P> 0.05)。PBC患者肝组织IL-15的表达与ALP、GGT水平均呈正相关(r值分别为0.241、0.407,P值分别为0.014、0.045)。结论 NK细胞活化受体NKG2D影响PBC肝内炎症的程度,且PBC晚期表达NKG2D的配体MICA,同时下调NKG2D。IL-15在PBC组表达随炎症程度的加重而增加,且与ALP、GGT水平呈正相关,提示NK细胞活化、细胞因子分泌异常参与PBC的发生发展,其IL-15可能作为一个辅助诊断PBC的指标。

外周血CD3^+CD161^+淋巴细胞检测在结核病诊断中的价值初探

目的检测外周血CD3^+CD161^+淋巴细胞在结核病人中的表达水平,探讨其应用价值。方法选择菌阳结核病人40例、菌阴结核病人37例、潜伏感染者20例、健康对照者30例。采用流式细胞仪检测各组人群外周血CD3^+CD161^+淋巴细胞水平。通过绘制ROC曲线,评价其对结核病的诊断效能。结果菌阳组和菌阴组CD3^+CD161^+淋巴细胞表达水平分别为(17.59±1.36)%和(16.89±0.83)%,均明显低于对照组[(30.05±1.27)%]和潜伏感染组[(26.88±1.30)%],差异有统计学意义(F=30.77,P<0.01)。根据绘制的ROC曲线,CD3^+CD161^+淋巴细胞在分辨对照组和菌阳组时曲线下面积(AUC)为0.945,敏感度为82.5%,特异度为93.33%;在分辨潜伏感染组和菌阳组时AUC为0.913,敏感度为82.5%,特异度为95%;在分辨对照组和菌阴组时AUC为0.892,敏感度为81.08%,特异度为96.67%;在分辨潜伏感染组和菌阴组时AUC为0.868,敏感度为81.08%,特异度为95.0%。结论结核病人CD3^+CD161^+淋巴细胞下降明显,能够较好地分辨菌阳和菌阴结核病患者与健康人和潜伏感染者,可考虑作为诊断结核病的候选分子标志。

黄芪含药血清对NK细胞活性及KLRK1表达的影响

目的:探讨黄芪含药血清对自然杀伤(NK)细胞活性及杀伤细胞凝集素样受体K1(KLRK1)表达的影响。方法:SD大鼠灌胃不同剂量的黄芪水煎剂制备黄芪含药血清。NK92MI细胞与不同剂量黄芪含药血清及对照血清孵育12 h后,采用乳酸脱氢酶释放测定法检测NK细胞对靶细胞YAC-1的杀伤活性,采用qPCR和western blot检测KLRK1 mRNA和蛋白表达。结果:不同浓度黄芪含药血清刺激12 h后NK细胞杀伤活性明显增强,KLRK1表达显著升高。结论:黄芪含药血清能活化NK细胞,其机制可能与其激活KLRK1有关。

晚期消化道恶性肿瘤NKG2A、NKG2D、sMICA的表达及其相关性研究

目的分析晚期消化道恶性肿瘤患者外周血NK细胞受体NKG2A、NKG2D及NKG2D配体sMICA的表达及其相关性，探讨其对恶性肿瘤患者免疫监视的意义。方法选取263例晚期消化道恶性肿瘤患者为试验组，66例健康志愿者作为对照组，采用流式细胞术（FCM）检测两组NKG2A、NKG2D的表达，酶联免疫吸附法（ELISA）检测两组sMICA的表达。结果试验组患者血清sMICA及NKG2A高于健康对照组[sMICA：（266．65±107．60）Pg／ml比（148．01±94．11）Pg／ml；NKG2A（37．17±20．54）％比（27．75±6．52）％，均P〈0．01]。NKG2D低于健康对照组[（83．92±10．46）％比（88．21±6．26）％，均P〈0．01]。Spearman相关性分析结果表明，试验组NKG2D与sMICA呈负相关r=-0．149，P：0．016。NKG2D与NKG2A、NKG2A与sMICA之间均无明显的线性相关关系（均P〉0．05）。结论检测外周血NK细胞受体NKG2A、NKG2D及NKG2D配体sMICA的表达水平，可监测消化道恶性肿瘤患者免疫功能状态，为恶性肿瘤的免疫治疗提供理论依据。

CLEC2D/CD161分子相互作用调节蜕膜自然杀伤细胞的免疫杀伤功能

目的研究孕早期CLEC2D/CD161分子相互作用对蜕膜自然杀伤细胞(decidual natural killer cell,dNK)免疫杀伤功能的调节作用,并探讨其与复发性流产发病的关联。方法2018年10月至2019年5月,孕6~10周的正常妊娠(n=16)及复发性流产(n=6)蜕膜组织取自北京大学第三医院妇产科。通过免疫荧光确定CLEC2D及CD161分子在早孕蜕膜中的分布。从早孕蜕膜中分离培养dNK,对dNK与JEG-3分别用CD161抗体阻断(blocking CD161,B-CD161)及CLEC2D小干扰RNA(siCLEC2D)敲降处理。经过共培养后,用细胞杀伤实验检测dNK的杀伤性。组间数据比较采用t检验。结果(1)CLEC2D主要分布于表达于绒毛外滋养层细胞(extravillous trophoblast,EVT)中,CD161主要表达于dNK中。并且CD161阳性的dNK和CLEC2D阳性的EVT在蜕膜中相邻分布,存在发生相互作用的空间位置条件。(2)B-CD161组效靶比40∶1、20∶1、10∶1及5∶1的靶细胞裂解率分别为(59.12±4.56)%、(25.96±5.44)%、(13.60±8.94)%和(12.53±8.94)%,其对照组IgG组对应效靶比靶细胞裂解率为(20.01±1.96)%、(8.51±1.32)%、(3.24±0.75)%和(3.82%±1.92)%。效靶比40∶1和20∶1时,裂解率均高于相应对照组(t=13.922,P<0.01;t=5.403,P<0.05);而10∶1和5∶1时,2组差异无统计学意义。siCLEC2D组效靶比40∶1、20∶1、10∶1和5∶1的靶细胞裂解率分别为(43.37±2.01)%、(32.99±2.08)%、(23.47±1.36)%和(11.48±0.37)%,其阴性对照组对应效靶比的靶细胞裂解率分别为(15.54±1.46)%、(13.84±1.68)%、(9.94±3.01)%和(5.50±0.99)%,2组之间各效靶比的裂解率差异均有统计学意义(t值分别为19.402、12.400、7.093和9.842,P值均< 0.01)。siCLEC2D组dNK杀伤性相关因子颗粒酶B的表达较阴性对照组升高。(3)复发性流产和正常妊娠蜕膜组织中CLEC2D的表达并无明显差异。复发性流产病例dNK中CD161的阳性率低于正常妊娠组。复发性流产dNK的杀伤性水平高于正常dNK。结论在早孕期蜕膜中,EVT可通过CLEC2D与dNK上的CD161相互作用,抑制dNK的杀伤性,实现免疫耐受。蜕膜CD161表达下降导致dNK杀伤能力增强,这可能是复发性流产的免疫排斥病因之一。