CD8^+CIK细胞表面NKG2D及TCR抗原识别受体的功能分析

目的探讨CD8^+细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)亚群表面T细胞受体(TCR)和NKG2D(即CD314)抗原识别受体在发挥抗肿瘤特别是卵巢癌免疫效应中的功能。方法 CIK细胞由卵巢癌志愿者外周血单个核细胞(PBMCs)制备而成,采用磁性细胞分选(MACS)技术从培养1周的CIK细胞中富集CD8^+亚群并继续培养扩增,获得高度均质性的CD8^+CIK细胞后进行表型检测。将CD8^+CIK细胞分别在CD3抗体和NKG2D抗体包被的培养板中进行培养,以CD137为CD8^+CIK细胞激活标志物,应用流式细胞术(FCM)检测CD137表达,评估CD8^+CIK细胞的激活状况。并检测经CD3抗体、NKG2D抗体刺激或与红白血病细胞株人类白细胞抗原(HLA)-主要组织相容性复合体-Ⅰ类相关分子(MIC)A/B+K562细胞共培养对CD8^+CIK细胞分泌γ-干扰素(IFN-γ)的影响。选用K562细胞作为CD8^+CIK细胞作用的靶细胞,应用NKG2D抗体阻断NKG2D与MICA/B相互作用,测试激活的CD8^+CIK细胞在NKG2D阻断状态下对靶细胞K562的杀伤能力。结果 TCR能够提供CD8^+CIK细胞的激活信号,而NKG2D不具备该功能。外周血单个核细胞(PBMC)中CD8^+细胞占24.2%,该细胞群中NKG2D阳性率为16.3%。CIK培养后CD8^+细胞比例增至88.1%,这些CD8^+CIK细胞均表达NKG2D,但其中仍含10%左右的CD8-细胞;CD3抗体组中CD137阳性率为88.8%;CD3抗体刺激后24h,约50%的CD8^+CIK细胞呈IFN-γ染色阳性,而NKG2D抗体刺激后,IFN-γ阳性率(4.8%和5.6%)高于对照组(2.9%),但明显低于CD3抗体;CD8^+CIK细胞经CD3抗体刺激24h后IFN-γ检测阳性率为41.9%,但与K562细胞按1:1比例共培养后阳性率仅为0.5%。CD8^+CIK细胞对K562细胞具有杀伤功能,即能够以HLA非限制的方式杀伤靶细胞。而在CD3-TCR复合物激活的CD8^+CIK细胞上阻断NKG2D与MICA/B相互作用后,CD8^+CIK细胞杀伤活性受到抑制。结论 CD8^+CIK细胞的激活主要通过CD3-TCR受体复合物,而非通过NKG2D受体。CD8^+CIK细胞的NKG2D受体与靶细胞表面相应配体结合后可以介导HLA非限制的抗癌功能,但NKG2D受体的此种作用比较有限。

MS患者CD94/NKG2A-bright和CD94/NKG2A-dim NK细胞亚群对IFN-β的差异性反应

目的:分析多发性硬化(MS)进展型患者不同表型NK细胞亚群对临床主要治疗方法的反应性差异。方法:分离患者外周血中的NK细胞,以流式细胞术根据表面抑制性受体CD94/NKG2A表达情况分为两个亚群CD94/NKG2A-bright和CD94/NKG2A-dim。分别加入IFN-β,测定两个亚群表面CD94/NKG2A变化及细胞增殖,同时检测两种亚群分泌IL-10和TGF-β情况。结果:CD94/NKG2A阳性表达的NK细胞占25.5%,其中CD94/NKG2A-bright和CD94/NKG2A-dim分别占其中的23.6%和76.4%。加入IFN-β,CD94/NKG2A-bright组增殖率明显低于CD94/NKG2A-dim组,CD94/NKG2A表达峰度变化不大。CD94/NKG2A-dim组中CD94/NKG2A表达显著增加。两个亚群分泌的IL-10和TGF-β与未刺激组相比,均有明显差异。CD94/NKG2A-bright和CD94/NKG2A-dim组间亦有明显差异。结论:IFN-β通过诱导NK细胞CD94/NKG2A表达在非特异免疫系统中抑制NK细胞;同时刺激IL-10和TGF-β分泌进一步发挥对免疫系统的抑制。CD94/NKG2A-bright和CD94/NKG2A-dim对IFN-β反应有差异性。

CD94/NKG2A-C型凝集素超家族抑制性受体

CD94/NKG2A是C型凝集素家族的抑制性受体,特异地表达在一些淋巴细胞表面,如自然杀伤细胞和T细胞,介导抑制性信号的传导。本文介绍了这种分子的结构,并探讨了这类受体的生物学意义。

NKG2D CAR-NK92细胞构建及其对多发性骨髓瘤细胞的杀伤作用

目的 构建并鉴定靶向自然杀伤细胞2组成员D配体(NKG2DL)的嵌合抗原受体NK92(CAR-NK92)细胞[分泌白细胞介素15受体a与白细胞介素15的复合物(IL-15Ra-IL-15)],并验证NKG2D CAR-NK92细胞对多发性骨髓瘤细胞的杀伤活性。方法 通过筛选NKG2D的胞外段连接4-1BB、 CD3ζ、 IL-15Ra-IL-15序列构建CAR载体,包装慢病毒并转导NK92细胞,获得NKG2D CAR-NK92细胞;CCK-8法检测NKG2D CAR-NK92细胞的增殖能力,ELISA检测其IL-15Ra的分泌,乳酸脱氢酶(LDH)法检测其杀伤效率;流式细胞术检测细胞活化性受体NK细胞受体p30(NKp30)、 NKp44、 NKp46的表达,凋亡细胞群的比例以及CD107α表达、胞内颗粒酶B(granzyme B)和穿孔素(perforin)的释放,以进一步验证NKG2D CAR-NK92细胞对肿瘤的细胞毒性作用机制;通过NKG2D抗体抑制效应细胞、组胺抑制肿瘤细胞后,LDH法检测对细胞杀伤效率的影响;构建NCG(NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Nju)小鼠多发性骨髓瘤异体移植模型,验证其体内抗肿瘤活性。结果 慢病毒转导后,NK92细胞的NKG2D表达显著增加;与NK92细胞相比,NKG2D CAR-NK92细胞的增殖能力稍弱,早期凋亡细胞群少于其亲本NK92细胞;NKG2D CAR-NK92对多发性骨髓瘤细胞的细胞毒性更强,在其培养上清液中可检测到IL-15Ra的分泌;NKp44蛋白在NKG2D CAR-NK92细胞上的表达量显著增加,活化效应增强;抑制试验显示,CAR-NK92细胞对MHC-Ⅰ类链相关蛋白A(MICA)和MICB阳性的肿瘤细胞的细胞毒性作用更依赖于NKG2D CAR和NKG2DL的相互作用;NKG2D CAR-NK92细胞经肿瘤细胞刺激后,granzyme B和perforin表达增加,且NK细胞显著上调CD107α的表达;在高度免疫缺陷NCG小鼠多发性骨髓瘤异体移植模型中,经NKG2D CAR-NK92细胞治疗的小鼠肿瘤明显缩小,且体质量无明显下降。结论 成功构建一种靶向NKG2DL的CAR-NK92细胞(分泌IL-15Ra-IL-15),其对多发性骨髓细胞的杀伤作用明显。

CD69^+/NKG2D^+比值在保健食品评价中应用

目的研究小鼠外周血自然杀伤细胞(NK)细胞分化抗原CD69+/NKG2D+检测在保健食品免疫调节作用评价中的应用。方法以左旋咪唑25mg(kg·bw)连续灌胃3d设立左旋咪唑阳性对照;进行小鼠外周血自然杀伤细胞(NK)亚群CD69+/NKG2D+检测和脾NK细胞活性测定试验,观察0.83,1.67g/(kg·bw)剂量组蛋白粉对小鼠NK细胞免疫功能的影响。结果与阴性对照组比较,左旋咪唑对照组和0.83,1.67g/(kg·bw)剂量组蛋白粉剂量组外周血NK细胞CD69-/NKG2D+、CD69+/NKG2D+比值以及脾NK细胞活性均明显升高。结论外周血NK细胞CD69+/NKG2D+检测与传统的NK细胞免疫检测结果有较好一致性,且方法敏感性较好,在保健食品免疫调节功能评价中有较好应用价值。

CD226在NK细胞亚群上表达规律与功能关系的研究

目的 :观察CD2 2 6分子在NK细胞亚群上的分布和其他NK细胞活化性受体和抑制性受体的共存规律 ,及与NK细胞功能的关系。方法 :分别以IL 2或IL 15刺激PBMC和MLC细胞为模型 ,采用双重免疫荧光染色和流式细胞术分析 ,观察CD2 2 6分子在CD5 6 bright和CD5 6 dim NK细胞亚群上的表达 ,及与NK细胞活化性受体CD16和抑制性受体NKG2A的共存关系 ,同时用ELISA方法检测培养上清中IFN γ的水平。用 4小时51 Cr释放试实验检测NK细胞杀伤水平。结果 :在PBMC中 ,CD2 2 6主要分布于CD5 6 dim亚群 ,在IL 2作用下 ,CD2 2 6主要分布于CD5 6 bright亚群 ,而在IL 15作用下 ,NKG2A+ CD2 2 6 + 双阳性细胞明显增加。在MLC活化的NK细胞中 ,CD2 2 6主要分布于CD5 6 dim亚群 ,在IL 15作用下 ,CD2 2 6主要分布于CD5 6 bright亚群 ,IL 2和IL 15都能促进CD16 + CD2 2 6 + 和NKG2A+ CD2 2 6 + 双阳性细胞的增殖。IL 2和IL 15能明显提高PBMC培养上清中IFN γ的水平 ,并能促进PBMC和MLC中NK细胞的杀伤活性。结论 :CD2 2 6主要分布于活化NK细胞CD5 6 bright亚群上 ,其表达水平及与CD16及NKG2A共存关系可能受不同细胞因子调节并与NK细胞功能相关。

阻断KIR2DL4(CD158d)增强NK细胞的杀伤功能

目的利用抗体阻断人原代培养的自然杀伤(NK)细胞表面的杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL4(KIR2DL4),抑制其与配体人白细胞抗原G(HLA-G)的结合,观察对NK细胞杀伤功能的影响。方法用免疫磁珠法分离人NK细胞并培养,流式细胞术检测所得NK细胞的纯度;流式细胞术检测NK细胞表面KIR2DL4的表达水平和人乳腺癌SK-BR-3细胞表面HLA-G的表达水平;将NK细胞与SK-BR-3细胞共培养,并加入KIR2DL4的阻断抗体,ELISA检测NK细胞分泌γ干扰素(IFN-γ)的水平,利用流式细胞术检测NK细胞表面CD107a的表达水平,以检测其脱颗粒情况。结果分离得到的人原代NK细胞纯度可达90%以上;共培养实验发现,KIR2DL4的阻断抗体可促进NK细胞分泌IFN-γ,且NK细胞表面CD107a的表达水平也明显提高,提示其脱颗粒能力增强。结论阻断KIR2DL4信号可明显促进NK细胞的杀伤功能,KIR2DL4在NK细胞杀伤靶细胞的过程中发挥抑制性作用。

NKG2D真核表达载体的构建及其对YT细胞生物学功能的影响

目的建立NK细胞受体NKG2D真核表达载体,通过转染NK细胞系YT,初步探讨NKG2D分子对YT细胞系杀伤功能的增强作用。方法用RT-PCR方法从NK-92细胞中调取NKG2D基因片段,克隆到pGEM-T Easy载体并对克隆的DNA片段进行序列分析。用限制内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ消化pGEM-T Easy/NKG2D重组质粒,分离NKG2D片段,并插入真核表达质粒pEGFP-N1的相应限制酶位点,酶谱分析鉴定重组表达载体pEGFP-N1/NKG2D。然后经脂质体介导转染CHO细胞和YT细胞。应用荧光显微镜观测、Western blot方法和免疫组化染色对转染细胞内pEGFP-N1/NKG2D的表达进行鉴定,MTT方法观察YT细胞对肿瘤细胞的杀伤功能。结果RT-PCR扩增获得650bp基因片段,经DNA序列分析证明所获得的DNA序列与文献报道的NKG2D序列一致。转染的CHO细胞在荧光显微镜下发出强绿色荧光,Western blot分析显示重组蛋白能特异地与抗人NKG2D单克隆抗体结合;免疫组化检测显示,转染的CHO中有棕色颗粒,证明所构建的NKG2D真核表达载体可以在细胞中表达;转染NKG2D真核表达载体的YT细胞对乳腺癌细胞具有更强的杀伤效果。结论所获得的表达NKG2D分子的真核表达载体,通过转染YT细胞,初步鉴定所表达NKG2D分子具有生物学功能,可以提高NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。

CD4^(+)CD25^(+)foxp3^(+)调节性T细胞通过NKG2D增强急性髓性白血病中NK细胞毒性

目的CD4^(+)CD25^(+)foxp3^(+)调节性T细胞在急性髓性白血病中调控NKG2D介导NK细胞毒性的研究。方法免疫磁珠法分离急性髓性白血病(AML)和健康对照外周血NK细胞和CD4^(+)CD25^(+)细胞,分析foxp3与NKG2D表达,CD4^(+)CD25^(+)foxp3^(+)细胞的比例与NK细胞的细胞毒作用相关性。Spearman法分析CD4^(+)CD25^(+)foxp3^(+)细胞比例与NK细胞的细胞毒性和NGK2D相关性。foxp3过表达处理AML外周血淋巴细胞后,流式细胞术检测NKG2D,IFN-γ和CD107a表达,LDH法检测NK细胞毒性。GEPIA2数据库分析AML患者NKG2D和foxp3基因表达相关性,TCGA数据库分析AML转录组数据中与NKG2D表达高相关性基因。IL-2(10μg/mL),IL-15(10μg/mL)处理NK细胞24 h后,流式细胞术检测NKG2D和CD107a表达,酶联免疫反应法检测NK细胞分泌的IFN-γ,LDH法检测NK细胞毒性。采用t检验等方法统计分析组间差异及变量相关性。结果与对照比较,AML组NK细胞中NKG2D表达(平均荧光强度MFI:942.25±117.17比3245.28±367.43)降低(P<0.001)。foxp3表达与NKG2D呈正相关性(r=0.590,P<0.001),NKG2D表达百分数与外周血淋巴细胞中CD4^(+)CD25^(+)foxp3^(+)细胞的比例呈正相关(r=0.708,P=0.002),AML患者外周血NK细胞活力也与CD4^(+)CD25^(+)foxp3^(+)细胞的比例呈正相关(r=0.655,P=0.006)。与OE-NC比较,OE-foxp3组细胞中NKG2D的表达水平(MFI:2115.37±269.53比914.28±103.36)、杀伤能力(58.24%±3.17%比24.18%±2.35%)、NK细胞毒性评估指标CD107a(45.43%±1.28%比18.24%±1.49%)和IFN-γ水平(24.16%±1.17%比16.28%±0.95%)升高(P均<0.001)。TCGA数据分析发现,NKG2D表达与CD3G、IL-3、IL-2、CD3E、IL-10、IL-17、IL-7R、IL-15、EZH2等基因相关性较高,流式细胞术检测发现,与对照比较,IL-2和IL-15处理后NK细胞的表面受体NKG2D和CD107a表达、IFN-γ水平、NK细胞毒性均升高。结论AML外周血中,NK细胞表面受体NKG2D低于正常对照,其中CD4^(+)CD25^(+)foxp3^(+)调节性T细胞通过IL-2和IL-15影响NKG2D表达进而调控NK细胞毒性。

NK细胞天然免疫受体与肿瘤免疫治疗

靶向负相共刺激因子CTLA-4和PD-1的单抗在肿瘤免疫治疗中展现了诱人前景，也成为Science推荐的2013年六大关注热点之一。目前国际上靶向负相分子的对策主要针对T细胞（尤其是cTL）的耗竭（Exhaustion），而有关专职抗癌的天然杀伤细胞（NaturalKillerCells，NKCells）的功能逆转的研究却鲜有报道。我们研究小组开展了二方面的研究：（1）针对新型负相共刺激因子TIGI和LARG3的研究；（2）针对NK细胞抑制性受体NKG2A的研究。

基于NK细胞受体的CAR-T细胞疗法在实体瘤治疗中的研究进展

嵌合抗原受体(CAR)T细胞免疫疗法属于过继性细胞免疫治疗,通过将CAR的特异性与T细胞免疫作用相结合,再经过特异性识别对恶性肿瘤细胞进行杀伤。NK细胞是免疫系统中发挥细胞毒作用最重要的细胞之一,主要依赖于其细胞膜表面的激活性受体和抑制性受体参与天然免疫和适应性免疫。基于NK细胞受体的CAR-T细胞可以识别表达其配体的病毒感染或者突变恶性细胞,具有多靶点、广谱性、不易耐药的特点,可以用于多种血液系统及实体性恶性肿瘤的治疗,应用前景良好。本研究梳理了CAR-T细胞疗法的原理及其局限性,以及基于NK细胞受体的CAR-T细胞疗法,分析了实体瘤中CAR-T细胞细胞免疫治疗的主要困难及其解决策略,重点探讨了NK细胞激活性受体NKG2D、NKp30及其配体分别在肿瘤治疗中的研究和应用,以期为基于NK细胞受体的CAR-T细胞疗法治疗实体瘤提供借鉴。

多种血液肿瘤中NK细胞受体表达差异的临床意义

目的:检测几种血液肿瘤患者中自然杀伤(NK)细胞受体变化,以探究NK细胞功能状态。方法:收集多发性骨髓瘤(MM)患者38例,其中IgG-k型18例、IgG-λ型10例、IgA-k型4例、IgA-λ型6例;非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者27例,其中弥漫性大B细胞淋巴瘤18例、边缘区淋巴瘤3例、滤泡性淋巴瘤1例、套细胞淋巴瘤2例、免疫母性T细胞淋巴瘤1例、外周T细胞淋巴瘤2例;慢性髓系细胞白血病(CML)患者10例;30例健康志愿者为正常对照组。通过流式细胞术测定外周血中NK细胞占有核细胞比例,用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)方法检测NK细胞表面抑制性受体(PD-1)及活化性受体(CD69、NKG2D)的基因表达水平。结果:与正常对照组比较,MM、NHL患者外周血NK细胞占有核细胞比例比较,差异无统计学意义(P均>0.05);而CML患者NK细胞占有核细胞数显著减少(P<0.05);MM、NHL及CML患者的NK细胞表面活化性受体(CD69、NKG2D)水平较正常对照组明显降低,NK细胞表面抑制性受体(PD-1)表达显著高于正常对照组(P均<0.05);MM、NHL及CML患者间受体(PD-1、CD69、NKG2D)表达比较,差异无统计学意义(P均>0.05)。结论:MM、NHL及CML患者外周血NK细胞表面活化性受体(CD69、NKG2D)水平明显降低,抑制性受体(如PD-1)表达明显增高,提示NK细胞功能耗竭。

人外周血NK细胞亚群的生物学特性

目的探讨人外周血NK细胞亚群的生物学特征。方法利用多种荧光标记抗体进行细胞表面和细胞内细胞毒效应分子染色,再利用流式细胞仪在单个细胞水平上分析NK细胞亚群的多样性和生物学特征。结果根据CD56和CD16分子表达与否将NK细胞分为CD56+、CD56+CD16+和CD16+三个亚群。CD56+、CD56+CD16+和CD16+NK细胞亚群表面CD95、NKG2D及细胞内穿孔素和颗粒酶B的表达存在明显差异,CD56+NK细胞亚群明显低于CD56+CD16+和CD16+NK细胞亚群,差异有统计学意义(P<0.05),而CD56+CD16+和CD16+NK细胞亚群之间则差异无显著性(P>0.05)。结论NK细胞乃异质性群体,随着CD56表达减少和CD16表达增加,其生物学功能逐渐成熟。

恶性血液病患者治疗前后外周血NK细胞亚群变化的特点及其临床意义

目的:探讨恶性血液病患者治疗前后外周血NK细胞亚群的变化特点及其临床意义。方法:应用流式细胞仪多参数检测法检测分析了20例急性白血病、18例淋巴瘤患者化疗前后外周血NK细胞亚群及其表面受体NKG2D表达的变化特点。并选取22例健康体检者作为对照组。结果:急性白血病及恶性淋巴瘤患者治疗前外周血NK细胞比例、NK细胞亚群中CD56dim比例及其NKG2D表达率均明显低于对照组(P<0.05),而CD56bright比例则明显上升(P<0.05)。化疗缓解后,急性白血病及淋巴瘤患者的外周血NK细胞比例、NK细胞亚群中CD56dim比例及其NKG2D表达率均较化疗前明显升高并恢复至正常,CD56bright比例则明显下降(P<0.05)。结论:化疗前后恶性血液肿瘤患者外周血NK细胞亚群有明显变化,尤其是化疗前CD56dim比例明显下降同时其表面NKG2D受体表达也明显降低,提示恶性血液肿瘤患者存在细胞免疫功能的不足,而且这种变化随着疾病治疗的缓解而得到一定程度的恢复。恶性血液肿瘤患者NK细胞亚群这种变化特点有助于疗效评价和预后判断,同时也为在治疗过程中以及缓解后加强免疫治疗提供了实验依据。

IL-2促进PBMC来源的NK、NKT、CD8^+ T细胞高表达NKG2D

目的观察大剂量IL-2活化的人外周血单个核细胞(PBMC)中,NKG2D在NK细胞、T细胞和NKT细胞表面的表达规律。方法使用三重免疫荧光标记的流式细胞术检测NKG2D的表达情况。使用sMICA蛋白与人PBMC共同培养,之后使用流式细胞术分析NKG2D在NK细胞中的表达情况。使用半定量RT-PCR方法检测大剂量IL-2活化的人PBMC中NKG2D及其锚定蛋白DAP10 mRNA的表达变化。结果使用大剂量IL-2活化人PBMC细胞后,NKG2D在NK细胞、CD8+T细胞和NKT细胞表面的表达均增加,但是在CD4+T细胞表面始终不表达。同时IL-2可以拮抗sMICA对NKG2D的下调作用。半定量RT-PCR结果显示,使用大剂量IL-2活化人PBMC之后,NKG2D及其锚定蛋白DAP10的mRNA水平并不发生明显变化。结论大剂量IL-2培养人PBMC之后,NKG2D在NK细胞、CD8+T细胞和NKT细胞表面的表达均增加,可能是PBMC活化并获得广谱抗肿瘤效应的机制之一。