骨髓瘤细胞来源外泌体对NK细胞表面活化受体的影响

目的:考察多发性骨髓瘤细胞系来源外泌体对NK细胞表面活化受体的影响,从外泌体水平探讨骨髓瘤患者中NK细胞功能缺陷的机制。方法:采用超速离心法提取多发性骨髓瘤细胞系RPMI 8226、U266培养上清液中外泌体,并采用电子显微镜鉴定外泌体的大小;提取人原代NK细胞,将40μg/ml外泌体与NK细胞共培养后,于0、1、4和24 h用流式细胞术检测NK细胞表面活化受体NKp30、NKG2D和NKp46的表达。结果:在电子显微镜下外泌体呈现囊泡状,大小30-100 nm;骨髓瘤细胞来源外泌体与NK细胞共培养后,NK细胞表面活化受体表达均有不同程度下降。结论:多发性骨髓瘤来源外泌体可以抑制NK细胞表面活化受体的表达。

EPO对糖尿病肾病大鼠NK细胞活化性受体及HMGB1/Beclin-1信号通路的影响

目的:基于HMGB1/Beclin-1信号通路探究EPO对糖尿病肾病大鼠NK细胞活化性受体的作用机制。方法:40只SPF级SD雄性大鼠随机分为正常(A)组、模型(B)组、二甲双胍(C)组、EPO(D)组,每组10只,对B、C、D组采用高脂饲料及链脲佐菌素进行糖尿病肾病建模。建模成功后,对C组灌胃100 mg/kg二甲双胍,对D组腹腔内注射100 U/kg EPO,A组、B组同期灌胃等体积生理盐水;另取20只大鼠建模,建模成功后,随机分为E组、F组,E组灌胃给予30 mg/kg HMGB1抑制剂,F组灌胃给予30 mg/kg HMGB1抑制剂和腹腔内注射100 U/kg EPO;取HK-2细胞,分为高糖+HK-2细胞(HH)组、EPO+高糖+HK-2细胞(EH)组、甘草酸苷L+高糖+HK-2细胞(LH)组,葡萄糖培养后进行细胞实验。血糖仪检测大鼠血糖,全自动生化分析仪检测大鼠生化指标,PAS染色法检测大鼠肾组织病理形态,免疫印迹法检测HMGB1/Beclin-1蛋白表达,RT-PCR及免疫组化法检测NK细胞活化性受体表达。结果:与A组比较,B组血糖及血糖曲线、血液及尿液中BUN、Scr、UAlb含量、NKp30、NKp44、NKp46的mRNA及蛋白表达明显升高(P<0.05),体质量明显降低(P<0.05);与B组比较,C组、D组血糖及24 h尿量、血糖曲线、血液及尿液中BUN、Scr、UAlb含量、NKp30、NKp44、NKp46 mRNA及蛋白表达均明显降低(P<0.05),体质量明显升高(P<0.05),肾脏病理学明显改善,且D组较C组变化显著(P<0.05);与A组比较,B组大鼠肾组织中HMGB1/Beclin-1蛋白表达显著升高(P<0.05),与B组相比,C、D、E、F组大鼠肾组织中HMGB1/Beclin-1蛋白表达均显著降低(P<0.05),且D组HMGB1/Beclin-1蛋白表达与C组相比降低明显(P<0.05),E组与D组无明显差异,F组较E组降低明显;HMGB1/Beclin-1蛋白表达与NKp30、NKp44、NKp46mRNA均呈正相关(P<0.05);与HH组相比,EH、LH组细胞增殖率显著升高(P<0.05),凋亡率及HMGB1/Beclin-1蛋白表达均显著降低(P<0.05),而LH组与EH组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论:EPO可有效降低糖尿病肾病大鼠NK细胞活化性受体表达,抑制HMGB1/Beclin-1信号通路,提示EPO可能通过调控NK细胞活化性受体及HMGB1/Beclin-1信号通路发挥作用,而NK细胞活化性受体表达与HMGB1/Beclin-1信号通路呈正相关。

晚期非小细胞肺癌患者外周血CD8^(+)T细胞表面NK相关受体表达及与预后的相关性分析

非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌中最常见类型之一,预后较差,5年生存率不足20%,尤其是晚期患者5年生存率仅2%左右[1-2]。寻找精准可靠、能够实时预测预后的指标成为临床亟待解决的问题。肿瘤免疫逃逸是肿瘤恶性进展的重要过程,其机制十分复杂,机体在清除肿瘤细胞时。

体外扩增对食管癌患者NK细胞表面受体表达及其抑瘤活性的影响

目的:探讨食管癌患者NK细胞扩增前后的受体表达及其对肿瘤细胞的杀伤。方法:收集福建省肿瘤医院食管癌患者外周血20例,健康供者(对照组)外周血10例。NK细胞培养采用细胞因子(IL-2+IL-12+IL-15+IL-18)组合,流式细胞术检测NK细胞免疫表型及其受体(CD56+、CD69+、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD158b、CD159a)的表达,LDH法检测不同效靶比时NK细胞对多种肿瘤细胞株(K562、Raji、Eca-109、TE-1)的杀伤作用。结果:与对照组相比,食管癌患者外周血CD3+、CD4+细胞比例以及CD4+/CD8+T细胞比值明显降低(P<0.05),NK细胞(CD3-CD56+)及调节性T细胞(Treg)比例明显升高(P<0.05)。经细胞因子IL-2+IL-12+IL-15+IL-18组合定向扩增20 d后,食管癌患者NK细胞比例高达90%以上,NK细胞数扩增达1 000倍以上(P<0.01);而CD3+T细胞、CD4+、CD8+T细胞、CD19+B细胞、Treg细胞及单核巨噬细胞(CD14+)比例均显著降低(P<0.01),且食管癌患者与对照组之间无统计学差异(P>0.05)。经细胞因子体外培养20 d后,NK细胞表面CD69及活化性受体(NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46)均明显上调,而抑制性受体(CD158b、CD159a)均明显下调(P<0.05)。培养20 d后,食管癌患者NK细胞对肿瘤细胞K562、Raji、Eca-109、TE-1的杀伤能力均显著高于培养前[(69.2±5.1)%vs(42.3±3.0)%,(44.6±3.2)%vs(21.1±2.0)%,(69.7±3.9)%vs(50.3±3.5)%,(67.1±4.5)%vs(41.2±3.3)%;均P<0.01]。结论:细胞因子IL-2+IL-12+IL-15+IL-18组合能有效扩增外周血NK细胞并上调其活并性受体的表达、下调抑制性受体的表达,其数量及功能均能满足临床治疗需要。

结直肠癌患者外周血淋巴细胞亚群比例及表面受体表达的变化

目的 根据结直肠癌T细胞、自然杀伤(NK)细胞、 NKT细胞表面蛋白受体表达情况,探索结直肠癌患者免疫功能评价体系。方法 收集144例结直肠癌患者和87例健康对照组的外周血样本,通过流式细胞术、细胞培养等方法,分析患者外周血淋巴细胞亚群表面受体与健康对照组的差异。结果 与健康对照组相比,结直肠癌患者外周血总淋巴细胞、 CD16^(bright)CD56^(dimN)K细胞、 NKT细胞百分比降低;T细胞、 CD16^(bright)CD56^(dim)NK细胞、 NKT细胞表面抑制型受体T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序结构域(TIGIT)百分比增加;T细胞、 NK细胞、 NKT细胞表面趋化因子受体CC趋化因子受体7(CCR7)略降低。结论 结直肠癌患者外周血NK细胞亚群比例及表面受体表达谱存在差异。

血清NK细胞活化性受体、γ干扰素与非小细胞肺癌患者病情程度、预后的相关性分析

目的分析血清NK细胞活化性受体(NKG2D)、γ干扰素(IFN-γ)与非小细胞肺癌(NSCLC)患者病情程度、预后的相关性。方法选取沧州市中心医院2020年5月—2021年5月收治的NSCLC患者150例为研究对象,根据TNM分期标准分为Ⅰ、Ⅱ期组50例和Ⅲ、Ⅳ期组100例。比较两组患者的血清NKG2D、IFN-γ、肿瘤标志物[癌胚抗原(CEA)、细胞角质蛋白19片段抗原21-1(CYFRA21-1)、糖类抗原125(CA125)]及6个月内病死率;采用Pearson法检验血清NKG2D、IFN-γ与肿瘤标志物的相关性;比较不同预后NSCLC患者血清NKG2D、IFN-γ;绘制ROC曲线,分析血清NKG2D、IFN-γ及两者联合预测NSCLC患者预后的价值。结果Ⅲ、Ⅳ期组血清NKG2D[(67.12±5.28)%]低于Ⅰ、Ⅱ期组[(81.50±7.33)%](P<0.05),血清IFN-γ[(23.67±5.74)ng/mL]、CEA[(43.76±6.48)ng/mL]、CA125[(35.62±6.03)u/mL]、CYFRA21-1[(11.69±1.86)ng/mL]高于Ⅰ、Ⅱ期组[(17.91±4.82)ng/mL、(21.53±4.62)ng/mL、(23.59±5.17)u/mL、(6.84±1.12)ng/mL](P<0.05)。Pearson相关性分析显示,血清NKG2D与CEA(r=-0.683)、CA125(r=-0.615)、CYFRA21-1(r=-0.704)均呈负相关(P<0.05);IFN-γ与CEA(r=0.512)、CA125(r=0.439)、CYFRA21-1(r=0.543)均呈正相关(P<0.05)。150例NSCLC患者病死率为22.67%(34/150)。Ⅲ、Ⅳ期组6个月内病死率为28.00%(28/100),Ⅰ、Ⅱ期组6个月内病死率为12.00%(6/50),经χ^(2)检验,差异有统计学意义(χ^(2)=4.868,P=0.027)。死亡组血清NKG2D[(58.58±5.62)%]低于非死亡组[(84.23±4.39)%](P<0.05),血清IFN-γ[(29.93±3.17)ng/mL]高于非死亡组[(20.95±2.20)ng/mL](P<0.05)。ROC曲线显示,IFN-γ、NKG2D及两者联合预测NSCLC患者预后的AUC分别为0.780(95%CI:0.673,0.942)、0.820(95%CI:0.675,0.955)、0.860(95%CI:0.761,0.984),敏感性分别为78.1%(95%CI:0.648,0.892)、82.6%(95%CI:0.713,0.955)、86.5%(95%CI:0.752,0.978),特异性为51.3%(95%CI:0.443,0.714)、53.6%(95%CI:0.467,0.735)、41.5%(95%CI:0.328,0.616)。结论血清NKG2D、IFN-γ与NSCLC患者病情程度、肿瘤标志物水平有关,且两者联合检测可有效预测患者早期预后。

人类NK细胞活化受体的研究进展

近年来,因为一大批活化和抑制性受体在功能和分子水平上得到阐明,使我们对NK细胞尤其是其表面表达的分子有了较为深入的了解。一方面,NK细胞表达HLA-I类分子特异的抑制性受体,由于宿主自身组织细胞表面HLA-I类分子表达正常而使杀伤抑制性受体介导产生的作用占主导地位,因此能使正常细胞免受NK细胞的杀伤;而另一方面,不同的活化受体参与NK细胞介导的细胞毒作用,他们参与人类NK细胞杀伤HLA-I类分子表达减少或缺失的靶细胞。本文主要就NK细胞的活化受体和协同活化受体以及它们的配体作一综述。

急性白血病患者非血缘脐血干细胞移植后NK细胞及其表面受体的早期重建

本研究探讨非血缘脐血移植(unrelated cord blood stem cell transplantation,UCBT)后早期NK细胞及其表面受体重建的特点和规律及其对临床的重要性。对11例接受UCBT的急性白血病患者使用流式细胞术分别检测UCBT后受者早期(植活后90天内)NK细胞及其表面受体的重建以及T细胞和B细胞的免疫重建情况。结果表明:UCBT后NK细胞重建较早,植活时外周血中NK细胞数即高于正常水平;植活后30天达峰值,60天时绝对值达峰值水平。NK表面活化性受体NKG2D的重建早,植活时即高表达,并逐步上升,约60天达峰值(82.55±9.10)%;NK细胞的另一种活化性受体NKp46也获得早期重建,至植活后90天仍维持在高水平。NK细胞抑制性受体NKG2A在UCBT后表达较活化性受体低并持续至移植后90天。UCBT后T细胞的重建较晚,表达水平低。结论:急性白血病患者UCBT后早期NK细胞的重建较早;NK细胞表面活化性受体特别是NKG2D的重建早于抑制性受体,提示NK细胞的活化可能在UCBT后早期移植物抗白血病(GVL)作用中承担了重要角色。

肾癌浸润NK细胞活化性受体表达及临床意义

目的:研究肾癌及癌旁组织中NK细胞表面活化性受体NKp44、NKp46表达情况,探讨活化性受体在肾癌发生发展中的临床意义。方法:流式细胞术及免疫组织化学法检测28例肾癌及癌旁组织中NK细胞含量及活化性受体NKp44、NKp46的表达,并结合临床相关因素进行统计学分析。结果:肾癌组织浸润的NK细胞含量明显高于癌旁组织(P<0.05)。肾癌与癌旁组织中活化性受体NKp44表达差异性明显。肾癌病理分级越高NK细胞含量越低,活化性受体NKp44表达也降低。而肾癌与癌旁组织中活化性受体NKp46的表达无统计学意义。结论:肾癌组织中有大量NK细胞浸润,NK细胞活化性受体NKp44表达很低,且NK细胞的含量及活化性受体NKp44的表达是与病理分级相关的。肾癌的发病可能与NK细胞减低及活化性受体NKp44表达降低有关。

自然杀伤(NK)细胞表面受体表达谱及其功能的研究进展

自然杀伤(NK)细胞抵御感染和肿瘤的能力,越来越受到研究者们的重视。NK细胞无需外界抗原刺激,即可发挥杀伤靶细胞的作用。NK细胞主要通过其表面多种激活和抑制性受体的调节,对抗肿瘤细胞和靶细胞的入侵。此外,NK细胞的两个主要亚型,为其抵御靶细胞提供物质基础:其中,CD56^dimCD16^+NK细胞,主要发挥细胞毒作用;CD56^brightCD16^-NK细胞,具有高分泌细胞因子的作用。NK细胞此种特异性,为其提供更多肿瘤免疫治疗的方向。我们阐述了NK细胞表面受体表达谱、主要识别机制和针对NK细胞的免疫治疗,以期为临床研究提供思路和方向。

识别乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的嵌合抗原受体NK92MI细胞的制备

目的构建识别乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的嵌合抗原受体(CAR)慢病毒表达载体,并使其在NK92MI细胞表达,制备识别HBsAg的CAR-NK92MI细胞。方法根据单链抗体(scFv)的序列,设计并合成CAR,构建慢病毒表达载体,将其包装、浓缩、测定滴度。然后用浓缩的慢病毒感染HEK293T细胞、Western blot法验证CD3ζ链的表达及在NK92MI细胞中的感染效率。结果成功构建识别HBsAg的CAR慢病毒表达载体,测得滴度≥10^(7)转导单位(TU)/mL。感染NK92MI细胞后,可表达CD3ζ蛋白。结论成功制备了识别HBsAg的CAR-NK92MI细胞。

NK细胞活化性受体及其配体在缺血性脑卒中模型小鼠脑组织中的表达变化

目的探讨NK细胞活化性受体(NKG2D)信号通路在缺血脑组织中的表达及其在缺血性脑损伤中的潜在作用。方法采用双侧颈总动脉持久性结扎法(2VO),构建C57BL/6雄性小鼠全脑缺血再灌注损伤模型组(2VO组)和假手术对照组(Sham组),每组12只。脑缺血20 min、再灌注72 h后,处死小鼠收集大脑,Nissl染色观察海马CA1区和纹状体CPu区神经元的损伤程度,实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹技术检测缺血脑组织中NKG2D及其配体(H60、Rae-1、Mult1)的表达,实时荧光定量PCR法检测NKG2D受体下游接头蛋白DAP10及促炎因子(TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS)的mRNA表达。结果Nissl染色结果显示,2VO组小鼠海马CA1区和纹状体CPu区的神经元严重损伤(P<0.001);2VO组小鼠缺血脑组织中NKG2D及其3种配体的mRNA水平和蛋白表达水平均高于Sham组(P<0.05);下游接头蛋白DAP10以及促炎因子的mRNA水平均明显高于Sham组(P<0.05)。结论脑缺血介导的NKG2D受体信号通路激活可能在小鼠脑缺血损伤炎症反应中发挥重要作用。

IL-12诱导肝癌微环境中NK细胞活化发挥抗肿瘤作用

目的:探讨IL-12通过诱导肝癌微环境中NK细胞活化诱导抗肿瘤的效果。方法:NOD/SCID小鼠皮下注射肝癌HepG2细胞,成瘤后腹腔注射人外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL),建立HCC-huPBL荷瘤小鼠模型。将荷瘤小鼠随机分为IL-12组和PBS对照组,瘤内注射IL-12后,观测荷瘤小鼠瘤体积、体重、一般状况的变化,IL-12瘤内注射后第30天ELISA法检测荷瘤小鼠肝癌组织微环境中IL-12、INF-γ含量以及小鼠外周血中天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate amin-otransferase,AST)及谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)的含量,免疫组化法检测IL-12治疗后肝癌微环境中NK细胞活化性受体NKG2D、NKp44、NKp30、NKp46,以及抑制性受体KIR2DL3/CD158b、NKG2A/CD159a的表达。结果:第12、18、24、30天IL-12组荷瘤小鼠瘤体积均小于PBS组[(594.47±205.51)vs(832.10±187.49)mm3,(963.61±427.95)vs(1 350.87±468.23)mm3,(1 285.02±368.56)vs(1 975.49±655.54)mm3,(1 903.64±471.34)vs(2 568.77±784.68)mm3,均P<0.05]。IL-12组小鼠肝癌组织中IL-12与INF-γ的表达水平均明显高于PBS组[(2.96±1.02)vs(1.35±0.75)pg/ml,(12.26±4.11)vs(7.81±3.46)pg/ml,均P<0.05]。IL-12组与PBS组相比,血清ALT水平第7天显著升高[(73.85±10.71)vs(41.73±13.13)U/L;P<0.05],第14天达到高峰。IL-12组治疗后肝癌组织中NK细胞活化性受体NKG2D、NKp44、NKp30的表达较PBS组高(P<0.05),NKp46的表达未见明显升高;而NK细胞抑制性受体CD158b和CD159a表达较PBS组低(P<0.05)。结论:肝癌模型小鼠瘤体内IL-12注射可上调瘤组织内NK细胞活化性受体、IL-12、IFN-γ的表达,下调抑制性受体的表达,从而抑制小鼠模型中肿瘤的生长。

原发性肝癌和癌旁组织中NK细胞受体表达及意义

目的:通过研究原发性肝癌和癌旁组织中NK细胞表面受体活化性及抑制性受体的表达,分析探讨这两种受体含量变化在原发性肝癌发生发展中的关系及其临床价值。方法:通过流式细胞术及免疫组织化学方法检测52例原发性肝癌组织及其癌旁组织中NK细胞数及其活化性、抑制性受体的表达,并结合临床相关因素进行统计学分析。结果:原发性肝癌的NK细胞数量明显低于癌旁对照组(P<0.01),原发性肝癌组织活化性受体NKG2D、NKP44明显低于癌旁组织(P<0.05),而抑制性受体CD158b、CD159a明显高于癌旁组织(P<0.05)。NKG2D、NKP30、NKP44的表达与肝癌临床分期负相关,即在早中期的患者含量较高,越晚期患者肝癌组织中NKG2D、NKP30、NKP44含量越低(P<0.05),NK细胞中抑制性受体CD158b、CD159a的含量在越晚期患者肝癌组织中含量越高(P<0.05)且与AFP高低有关及HBsAg的感染有联系。而NK受体的表达在是否有远处转移、肿瘤分化程度之间以及不同的病灶大小之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:原发性肝癌发病可能与NK细胞减低及NK细胞活化性受体表达降低、抑制性受体表达升高有关。

NK细胞免疫球蛋白样受体与异基因造血干细胞移植的研究进展

NK细胞免疫球蛋白样受体（killer cell immunoglobulin-like receptors，KIR）是主要表达于人NK细胞表面的受体，在所有人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）I类分子所识别的NK细胞独特型受体中，免疫球蛋白样超家族受体KIR占主导地位。由于它的配体参与多种免疫反应，因此，KIR在机体抗感染免疫、肿瘤免疫和移植免疫中都发挥重要作用。

结核性胸液中NK细胞的亚群及表型功能特征分析

目的探讨结核性胸液(PFC)中NK细胞的亚群分布及表型功能特征。方法以正常人外周血单个核细胞(PBMC)作对照,利用多种标记抗体进行表面和细胞内细胞毒效应分子染色,再利用流式细胞仪在单个细胞水平上分析结核性胸水中NK细胞亚群的异质性和生物学特征。结果 NK细胞可以分为CD56+CD16-、CD56+CD16+和CD56-CD16+三个亚群,与PBMC中的NK细胞相比,PFC中CD56+CD16-NK细胞亚群明显增加,而CD56+CD16+NK细胞亚群比例明显下降;结核性胸液中CD56+CD16-及CD56+CD16+NK细胞亚群表达较低水平的颗粒酶B,CD107a/b的比例在结核性胸液中3个NK细胞亚群中均有增加(P<0.05)。结核性胸液中NK细胞表达高水平表面抑制性受体NKG2A及表面活化性受体NKG2D。活化分子CD69及CD25在结核性胸水中NK细胞上的表达均有所增加(P<0.05)。结论结核性胸液中的NK细胞比例与PBMC相比发生变化,结核性胸液中的NK细胞表达低水平杀伤分子颗粒酶B但表达高水平活化分子CD69,提示NK细胞在结核感染中发挥其生物学功能。

生长激素对人外周血来源NK细胞杀伤活性的影响及机制探讨

目的观察生长激素(GH)对人外周血来源自然杀伤(NK)细胞杀伤活性的影响,并探讨其机制。方法选取10名健康志愿者,采用免疫磁珠法分离并培养其外周血NK细胞。将NK细胞分为A、B、C组,分别与终浓度0、5、20μg/mL的重组人GH共培养48 h。以人类髓性白血病K562细胞为靶细胞,NK细胞为效应细胞,按不同的效靶比(25∶1、50∶1、100∶1)混合,采用CCK-8法检测NK细胞对K562细胞的杀伤率;取各组培养48 h的NK细胞,分别采用流式细胞术和Real-time RT-PCR法检测NK细胞表面活化受体NKG2D蛋白及基因。结果三个不同效靶比下,B、C组NK细胞对K562细胞的杀伤率高于A组,且C组高于B组(P均<0.01)。A、B、C组NKG2D阳性表达的NK细胞百分数分别为78.8%±2.8%、87.5%±3.1%、91.8%±3.3%,B、C组NKG2D阳性表达的NK细胞百分数高于A组(P均<0.05)。A、B、C组NKG2D mRNA相对表达量分别为1±0.01、5±2.32、10±3.21,B、C组NKG2D mRNA相对表达量高于A组,且C组高于B组(P均<0.05)。结论 GH可通过上调NK细胞NKG2D的表达,增强其杀伤活性。