人参多糖对NK92-MI细胞杀伤活性的影响及机制

目的:研究人参多糖对NK92-MI杀伤活性的影响及机制。方法:采用200mg/L或400mg/L GPS作用于NK92-MI细胞,24h后收集细胞,采用CCK-8试剂盒检测GPS对NK92-MI细胞杀伤活性和增殖活性的影响;采用流式细胞术检测GPS对NK92-MI细胞活化受体(NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D)表达的影响;采用western blot技术检测NK细胞杀伤介质(穿孔素和颗粒酶B)表达水平。结果:与正常对照组相比,GPS可明显促进NK细胞杀伤活性,上调活化受体(NKp30、NKp44、NKp46)、杀伤介质(穿孔素和颗粒酶B)的表达水平(P<0.05)。结论:GPS通过上调活化受体(NKp30、NKp44、NKp46)的表达促进NK92-MI细胞的活化,并且通过上调杀伤介质(穿孔素和颗粒酶B)的表达提高NK92-MI细胞的杀伤活性。

Gs在SP活化NK92-MI细胞中的作用

为探索SP调控NK92-MI细胞功能的作用途径,研究Gs在SP活化NK92-MI细胞中的作用。采用CCK-8试剂盒检测Gsα特异性拮抗剂NF449对SP活化的NK92-MI细胞杀伤活性和增殖活性的影响;用Real-Time PCR技术检测NF449对SP活化的NK92-MI细胞IFN-γ和LFA-1 mRNA表达的影响。结果显示:NF449对SP的促杀伤和促进IFN-γmRNA表达的活性具有阻断作用;NF449对SP的促增殖活性无明显影响,NF449和SP对LFA-1 mRNA的表达均无明显影响。表明SP可通过Gs介导的信号通路促进IFN-γmRNA的表达,这可能是SP促进杀伤活性的机制之一。

P物质活化NK92-MI细胞脱颗粒及差异circRNA表达的研究

目的探讨神经肽P物质(substance P,SP)活化NK92-MI细胞脱颗粒作用,分析差异表达circRNA调控NK92-MI细胞可能的机制。方法将培养后的NK92-MI细胞分为空白对照组、SP刺激组和NK-1受体拮抗剂(neurokinin-1 receptor antagonist,NK-1RA)组。荧光定量PCR(real-time quantification PCR,qRT-PCR)法检测并分析NK92-MI细胞经SP刺激后穿孔素mRNA表达的时间效应,流式细胞术检测NK92-MI细胞脱颗粒标志物CD107a的表达,高通量测序技术分析circRNA表达谱,qRT-PCR法验证差异倍数最大的circZNF609和circAMBRA1的表达。生物信息学分析circZNF609、circAMBRA1与穿孔素相关的微小RNA(microRNA,miRNA),并分析circZNF609、circAMBRA1与穿孔素mRNA表达的相关性。结果刺激12 h后,SP刺激组穿孔素mRNA表达较对照组升高约2.06倍,刺激24 h后,穿孔素mRNA表达继续升高,约为对照组3.65倍,差异均具有统计学意义(t值分别为4.00、4.72,P值均<0.05);在12 h时,NK-1RA组穿孔素mRNA的表达高于对照组,差异具有统计学意义(t=2.39,P<0.05),但在24 h时,与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与静息NK92-MI细胞组相比,K562刺激组、K562+SP组、K562+SP+NK-1RA组中NK92-MI细胞CD107a的表达显著升高{(0.81±0.38)%比[(9.59±2.52)%,(17.78±1.94)%,(10.19±2.04)%],t值分别为6.27、12.19、7.83,P值均<0.05}。SP作用NK92-MI细胞后共有9个差异表达的circRNAs:circZNF609、circAMBRA1、circCAMSAP1、circAAGAB、circLMBR1、circGNB1、circBPTF、circGPI和circCSNK1G3。NK-1RA可以阻断除circCSNK1G3外的上述8个circRNAs的表达。qRT-PCR验证circZNF609和circAMBRA1的表达与测序结果一致。生物信息学预测,circZNF609、circAMBRA1与穿孔素相关的miRNAs为miR-149-5p、miR-940和miR-942-5p。circZNF609、circAMBRA1与穿孔素mRNA的表达均呈负相关(r值分别为-0.57、-0.74,P值均<0.05)。结论SP可以通过与NK-1R结合活化NK92-MI细胞,下调circZNF609和circAMBRA1的表达,上调穿孔素mRNA的表达,促进NK92-MI细胞脱颗粒增强其杀伤功能。

生物肽SP对NK-92MI细胞迁移及趋化因子受体表达的影响

探讨生物肽P物质(substance P,SP)对NK92-MI细胞迁移力和细胞表面趋化因子受体表达的影响,能更好地解释SP调控NK细胞迁移的作用机制,为NK细胞的功能研究及潜在的免疫疗法提供补充依据。Transwell法检测SP对NK92-MI细胞迁移能力的影响及SP对趋化因子CCL21和CXCL12对NK92-MI细胞趋化作用的影响;Real-time PCR检测SP对CCR7和CXCR4 mRNA表达水平的影响;流式细胞术检测SP对CCR7和CXCR4膜表达水平的影响。结果显示:①SP促进NK92-MI细胞的迁移,是在低浓度范围(10^-12~10^-10 mol/L)随SP浓度增加,促进作用逐渐增强,高浓度范围(10^-8~10^-6 mol/L)随SP浓度增加,促进作用又有所减弱,SP浓度在10^-10 mol/L时,趋化指数达峰值;SP增强趋化因子CCL21和CXCL12对NK92-MI细胞的趋化作用,这种增强作用在10^-10 mol/L浓度最显著。②SP在10^-12~10^-6 mol/L浓度范围内均能明显促进CCR7 mRNA的表达,且CCR7 mRNA表达水平随着SP浓度增加而增高;SP在10^-10~10^-6 mol/L浓度范围内能明显促进CXCR4 mRNA的表达。③CCR7的膜表达水平随着SP浓度的增加具有逐渐增高的趋势,在10^-8 mol/L和10^-6 mol/L浓度组,CCR7的表达有明显增加;而CXCR4的膜表达则随SP浓度的增加,具有先增高后回降的趋势,在10^-10 mol/L和10^-8 mol/L浓度组,CXCR4的表达有明显增加。SP能直接促进NK92-MI细胞的迁移,说明SP对NK细胞具有直接趋化作用;SP通过上调趋化因子受体CCR7和CXCR4的表达水平,协同趋化因子,间接发挥对NK-92MI细胞的趋化作用。

生物肽SP对NK细胞NKG2D/NKG2A受体表达的影响

选择NK92-MI细胞为研究体系,研究SP对NK细胞的杀伤活性及功能性受体NKG2D/NKG2A表达的影响,以探讨SP对NK细胞功能的调节作用机制。采用MTT法测定NK92-MI细胞对K562细胞的杀伤活性;采用Real-Time PCR和流式细胞术检测NK92-MI细胞活化性受体NKG2D和抑制性受体NKG2A的基因表达和膜表达。10-14～10-8 mol/L的SP在体外可明显增强NK92-MI细胞的杀伤活性。该浓度范围的SP均可上调NKG2D/NKG2A的mRNA水平;10-14～10-8 mol/L的SP均上调NKG2D/NKG2A的膜表达,较低浓度(10-14 mol/L)的SP仅使NKG2D表达上调,而NKG2A表达无明显变化;SP刺激NKG2D膜表达增加的程度高于NKG2A。生物肽SP调节NK细胞功能性受体NKG2D/NKG2A的表达,可能是SP增强NK细胞杀伤活性的一种原因。