甲基营养型芽胞杆菌NKG-1对番茄灰霉病的防治效果及全基因组分析

为了研究甲基营养型芽胞杆菌NKG-1对番茄灰霉病的防治效果,采用NKG-1发酵液处理番茄灰霉菌,观察番茄灰霉菌菌丝生长状态,测定菌丝干重、抑菌率,调查其对番茄离体叶片、苗期灰霉病防治效果。结果显示甲基营养型芽胞杆菌NKG-1显著抑制番茄灰霉菌菌丝的生长和产孢,对番茄离体叶片灰霉病防治效果达80.00%,对苗期番茄灰霉病的防治效果达73.14%。通过对NKG-1全基因组进行分析预测,发现该菌含有12个次级代谢产物基因簇,其中脂肽类抗生素表面活性素和丰原素具有抑菌作用,且丰原素已被证实具有强烈的抗真菌活性。本研究为甲基营养型芽胞杆菌NKG-1防治番茄灰霉病的应用和解析防病机理提供了重要的理论基础。

NKG2A-HLA-E轴介导NK细胞应答在病毒感染性疾病中的作用及机制研究进展

自然杀伤(NK)细胞主要通过迅速释放细胞毒性介质以及细胞因子直接杀伤病毒感染的靶细胞。NK细胞表面抑制性和活化性受体的平衡以及靶细胞上相应配体的表达均参与调控NK细胞的杀伤功能。其中NK细胞2组成员A(NKG2A)是NK细胞上备受关注的抑制性受体之一,通过与其配体人类白细胞抗原E(HLA-E)的相互作用,可抑制NK细胞对自身正常组织细胞的杀伤活性。研究发现病毒感染细胞表面HLA-E表达上调,并且可与病毒蛋白来源的多肽结合形成复合物,通过与NKG2A的相互作用调控NK细胞功能,从而参与病毒感染性疾病发病过程。本文总结了NKG2A与HLA-E分子互作特点,以及NKG2A-HLA-E轴参与调控NK细胞的功能机制,有助于了解NK细胞在病毒感染性疾病中的重要作用。

1565nm非剥脱点阵激光联合侧柏叶酊对斑秃小鼠IFN-γ信号及NKG2D^(+)CD8^(+)T细胞比例的影响

目的研究1565 nm非剥脱点阵激光联合侧柏叶酊干预对斑秃小鼠干扰素-γ(IFN-γ)信号与NKG2D^(+)CD8^(+)T细胞的影响。方法将50只雄性C3H/HeJ小鼠随机分为正常组、模型组、点阵激光组、侧柏叶酊组及点阵激光联合侧柏叶酊组,每组10只。除正常组外,其余组小鼠均采用环磷酰胺诱导斑秃。在造模期间,点阵激光组给予1565 nm非剥脱点阵激光治疗;侧柏叶酊组给予5%侧柏叶酊在脱毛部位轻微按摩2~3 min;点阵激光联合侧柏叶酊组给予1565 nm非剥脱点阵激光及5%侧柏叶酊按摩治疗。观察各组小鼠皮肤状态和毛发生长情况;实验第7天取血,流式细胞术检测血液中NKG2D^(+)CD8^(+)T细胞比例,Western blot法检测毛囊组织中IFN-γ及其受体IFNGR1和IFNGR2表达情况。结果模型组小鼠斑秃部位的毛发出现断裂、变细,裸露皮肤表面出现黑点;各干预组斑秃情况均较模型组轻,其中点阵激光联合侧柏叶酊组最轻。模型组血液中NKG2D^(+)CD8^(+)T细胞比例和毛囊组织中IFN-γ、IFNGR1、IFNGR2蛋白相对表达量均明显高于正常组(P均<0.05)。点阵激光组、侧柏叶酊组仅毛囊组织中IFN-γ蛋白相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05),点阵激光联合侧柏叶酊组血液中NKG2D^(+)CD8^(+)T细胞比例和毛囊组织中IFN-γ、IFNGR1、IFNGR2蛋白相对表达量均明显低于模型组及点阵激光组、侧柏叶酊组(P均<0.05)。结论1565 nm非剥脱点阵激光联合侧柏叶酊外用可通过抑制IFN-γ信号通路和NKG2D^(+)CD8^(+)T细胞的积累,从而有效改善斑秃。

婴儿巨细胞病毒感染与NKG2C拷贝数变异的相关性研究

目的探索婴儿巨细胞病毒感染与NKG2C拷贝数变异的相关性。方法选取2020年2月至2021年10月期间在广东省妇幼保健院医学遗传中心进行巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)检测的婴儿(6个月龄内)尿液样本共117例,经巨细胞病毒检测和NKG2C拷贝数分析,分析婴儿HCMV感染的相关因素,探索婴儿HCMV感染与NKG2C拷贝数是否存在相关性。结果对117例婴儿尿液通过荧光定量PCR检测HCMV,发现存在HCMV感染34例,未感染83例;感染患儿中,低HCMV病毒载量(5.1×102~1.0×103copies/ml)的为14例,高HCMV病毒载量(>1×103 copies/ml)的病例数为20例;统计分析显示,HCMV感染和未感染患儿NKG2C数(0拷贝,1拷贝,2拷贝)携带率无显著性差异;在所有感染患儿中,高HCMV病毒载量(>1×103copies/ml)的患儿携带较高频率的缺失型NKG2C,存在显著性差异(P<0.05)。结论本实验结果提示NKG2C的拷贝数分布与HCMV感染无关联,但在感染HCMV后,高、低病毒载量患儿NKG2C基因拷贝数分布频率存在显著差异,提示NKG2C受体可能在NK细胞介导的抗HCMV感染中起到作用,具体机制需要进一步的研究证实。

微小RNA-384靶向NK细胞表面受体NKG2A及STAT3蛋白对胃癌细胞生物学行为的作用机制

目的:探究微小RNA-384靶向NK细胞表面受体NKG2A及STAT3表达对胃癌细胞生物学行为的作用机制。方法:选取滕州市中心人民医院2017年4月至2020年3月已确诊的46例胃癌患者癌组织与癌旁组织标本进行研究。胃癌细胞分为胃癌组(胃癌细胞组)、对照组(转染NC组)、转染组(转染miRNA-384组)。PT-PCR检测胃癌细胞miR-384、NKG2A mRNA水平。MTT检测细胞增殖。流式细胞仪检测细胞凋亡。Western blot检测STAT3、Survivin蛋白水平。双荧光酶报告检测miR-384、NKG2A靶向关系。结果:与癌旁组织相比,胃癌组织中miR-384表达降低、NKG2A表达升高(P<0.05)。与转染miR-384-NC组相比,转染miR-384组NK细胞增殖率随着时间延长而升高,CD16+、CD56+阳性率显著升高(P<0.05),提示转染miR-384后,可促进NK细胞增殖。胃癌组与对照组相比各指标差异均无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,转染组miR-384、凋亡率升高,NKG2A表达、增殖率、STAT3、Survivin表达降低(P<0.05)。NKG2A与STAT3表达呈正相关(r=0.327,P=0.003);NKG2A与Survivin表达呈正相关(r=0.415,P<0.001);STAT3与Survivin呈正相关(r=0.351,P=0.001)。转染miR-384后野生型胃癌细胞中NKG2A活性及STAT3表达降低(P<0.05),突变型胃癌细胞中NKG2A及STAT3表达无明显变化(P>0.05),表明NKG2A及STAT3是miR-384的靶基因。结论:miR-384通过靶向NK细胞表面受体NKG2A及STAT3表达,降低Survivin活性,促进胃癌细胞凋亡并抑制其增殖。

NKG2D CAR-NK92细胞构建及其对多发性骨髓瘤细胞的杀伤作用

目的 构建并鉴定靶向自然杀伤细胞2组成员D配体(NKG2DL)的嵌合抗原受体NK92(CAR-NK92)细胞[分泌白细胞介素15受体a与白细胞介素15的复合物(IL-15Ra-IL-15)],并验证NKG2D CAR-NK92细胞对多发性骨髓瘤细胞的杀伤活性。方法 通过筛选NKG2D的胞外段连接4-1BB、 CD3ζ、 IL-15Ra-IL-15序列构建CAR载体,包装慢病毒并转导NK92细胞,获得NKG2D CAR-NK92细胞;CCK-8法检测NKG2D CAR-NK92细胞的增殖能力,ELISA检测其IL-15Ra的分泌,乳酸脱氢酶(LDH)法检测其杀伤效率;流式细胞术检测细胞活化性受体NK细胞受体p30(NKp30)、 NKp44、 NKp46的表达,凋亡细胞群的比例以及CD107α表达、胞内颗粒酶B(granzyme B)和穿孔素(perforin)的释放,以进一步验证NKG2D CAR-NK92细胞对肿瘤的细胞毒性作用机制;通过NKG2D抗体抑制效应细胞、组胺抑制肿瘤细胞后,LDH法检测对细胞杀伤效率的影响;构建NCG(NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Nju)小鼠多发性骨髓瘤异体移植模型,验证其体内抗肿瘤活性。结果 慢病毒转导后,NK92细胞的NKG2D表达显著增加;与NK92细胞相比,NKG2D CAR-NK92细胞的增殖能力稍弱,早期凋亡细胞群少于其亲本NK92细胞;NKG2D CAR-NK92对多发性骨髓瘤细胞的细胞毒性更强,在其培养上清液中可检测到IL-15Ra的分泌;NKp44蛋白在NKG2D CAR-NK92细胞上的表达量显著增加,活化效应增强;抑制试验显示,CAR-NK92细胞对MHC-Ⅰ类链相关蛋白A(MICA)和MICB阳性的肿瘤细胞的细胞毒性作用更依赖于NKG2D CAR和NKG2DL的相互作用;NKG2D CAR-NK92细胞经肿瘤细胞刺激后,granzyme B和perforin表达增加,且NK细胞显著上调CD107α的表达;在高度免疫缺陷NCG小鼠多发性骨髓瘤异体移植模型中,经NKG2D CAR-NK92细胞治疗的小鼠肿瘤明显缩小,且体质量无明显下降。结论 成功构建一种靶向NKG2DL的CAR-NK92细胞(分泌IL-15Ra-IL-15),其对多发性骨髓细胞的杀伤作用明显。

NKG2D及其配体治疗胃癌的研究进展

自然杀伤细胞2D(natural killer cell 2D,NKG2D)及其配体在NK细胞识别、启动、增强或抑制淋巴细胞效应功能上发挥着重要作用。近年来,随着肿瘤免疫逃避研究的深入,NK细胞上的NKG2D受体成为一个研究热门。胃癌作为严重影响人类寿命的疾病,其治疗一直是难以突破的难题。近年来,针对癌症的免疫治疗取得了重大突破。NKG2D及其配体可能是一个潜在的免疫治疗方向,故本文综述了NKG2D及其配体治疗胃癌的研究进展。

NKG2D/NKG2DL轴与肿瘤免疫治疗

自然杀伤(NK)细胞是固有免疫系统中发挥细胞毒性作用的淋巴细胞,而NKG2D是NK细胞最重要的活化性受体之一,它通过识别靶细胞表面的配体NKG2DL来传递活化信号并激活免疫细胞对靶细胞发挥杀伤作用,在肿瘤免疫治疗中发挥重要作用。肿瘤微环境(TME)内存在多种机制调节NKG2D和NKG2DL的表达,从而影响免疫系统对肿瘤细胞的清除并导致肿瘤逃逸。NKG2D的强激活作用及其配体NKG2DL在肿瘤细胞上的选择性表达,使NKG2D/NKG2DL轴成为肿瘤免疫治疗的潜在靶点。本文围绕NKG2D/NKG2DL轴介导的免疫监视与逃逸的双重作用,揭示重塑TME对肿瘤免疫的重要性;并就干预NKG2D/NKG2DL轴在肿瘤免疫治疗中的研究进展进行综述,为基于NKG2D/NKG2DL开发免疫治疗药物提供可靠依据和新思路。

肺癌患者MASP-2、NKG2D水平与病理生理特征的相关性

目的探讨肺癌患者甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2(mannanbinding lectin associated serine proteases-2,MASP-2)、自然杀伤细胞2D(natural killer cell 2D,NKG2D)水平与病理生理特征的相关性。方法选择2018年8月—2021年4月河南省荣军医院的104例肺癌患者作为肺癌组,同时选择68名同期健康体检者作为对照组。比较两组研究对象MASP-2、NKG2D的表达水平,并分析肺癌组患者MASP-2、NKG2D表达水平与其病理特征的相关性。运用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)分析MASP-2、NKG2D单独检测及联合检测对肺癌的诊断价值。结果肺癌组MASP-2水平(424.55 vs.221.48,P<0.001)显著高于对照组,而NKG2D水平(74.42 vs.84.23,P<0.001)低于对照组。MASP-2、NKG2D水平在肺癌中呈中度相关(r=0.554,P<0.05)。MASP-2水平在非小细胞肺癌、Ⅲ-Ⅳ期、中高分化、有远处转移患者中较高(P<0.05);NKG2D在Ⅲ-Ⅳ期、中高分化、有淋巴结转移、有远处转移患者中显著降低(P<0.05)。ROC分析显示,MASP-2预测肺癌的曲线下面积(AUC)为0.648[95%CI(0.526,0.984),P=0.024)],诊断界值为416.24 ng/mL时,敏感度为68.65%、特异度为52.89%;NKG2D预测肺癌发生的AUC为0.628[95%CI(0.517,1.023),P=0.036],诊断界值为76.38 pg/mL时,敏感度为63.38%、特异度为67.26%;二者联合预测肺癌发生的AUC为0.723[95%CI(0.634,0.947),P=0.011],敏感度为84.79%、特异度为67.14%。结论MASP-2和NKG2D可能参与了肺癌的发生发展,联合诊断价值较高,有望成为肺癌新的肿瘤标志物。

NKG2D在细胞因子诱导的杀伤性细胞(CIK)抗血液肿瘤细胞的作用

本研究探讨细胞因子诱导的杀伤性细胞(CIK)通过NKG2D受体和配体相互作用杀伤血液肿瘤细胞的机制。用含有rhIL-2,抗CD3抗体,IFN-γ的培养液培养健康人的外周血单个核细胞(PBMNC)2周后,用流式细胞仪分析CIK细胞的细胞亚群以及细胞表面NK细胞受体,同时检测血液肿瘤细胞株表面NKG2D配体的表达水平。CAM标记靶细胞,用流式细胞仪检测CIK细胞对血液肿瘤细胞的杀伤作用。结果表明,大部分CIK细胞为CD3+细胞(97.85±1.95%),CD3+CD8+细胞和CD3+CD56+细胞的比率较培养前明显升高(P<0.001;P=0.033);约86%的CIK细胞表达NKG2D受体,几乎不表达CD158a,CD158b和NCR受体;血液肿瘤细胞株U266、K562和Daudi均表达一定水平的NKG2D配体,CIK细胞对这3种血液肿瘤细胞株均具有较高的杀伤作用,这种杀伤作用可以被抗NKG2D抗体部分抑制(U266 52.67±4.63%vs 32.67±4.81%,P=0.008;K562 71.67±4.91%vs 50.33±4.91%,P=0.007;Daudi 68.67±5.04 vs 52.67±2.60%,P=0.024)。结论:大多数的CIK细胞表达NKG2D受体,NKG2D受体和配体的相互作用可能是CIK细胞杀伤血液肿瘤细胞的作用机制之一。

服用扶正抗癌方前后非小细胞肺癌患者CD8+T细胞表达NKG2D与其细胞毒活性的相关性分析

目的:探索服用扶正抗癌方后非小细胞肺癌(NSCLC)晚期患者CD8+T细胞表达NKG2D与其细胞毒活性的相关性。方法:NSCLC晚期患者共31例,依据服用扶正抗癌方前后分为治疗前和治疗后组,流式细胞术检测外周血CD8+T细胞绝对值、CD8+T细胞表达NKG2D、NKG2A、CD107a、颗粒酶B和IFN-γ。结果:连续服用扶正抗癌方1个月,CD8+T细胞的绝对数量以及CD8+T细胞表达NKG2D和分泌IFN-γ均显著升高,NKG2D+CD8+T与IFN-γ+CD8+T的百分比呈正相关。NKG2D+CD8+T的百分比的升高与治疗后生存质量评价等级的提升有关。结论:扶正抗癌方使NSCLC晚期患者CD8+T细胞表达NKG2D和分泌IFN-γ明显提升,有助于改善患者的生存质量和预后。

肿瘤患者自然杀伤细胞受体NKG2A和NKG2D的表达

目的通过研究肿瘤患者外周血自然杀伤(NK)细胞表面NKG2A和NKG2D的表达情况,探讨二者表达失衡与肿瘤免疫逃逸的关系。方法采用流式细胞术检测40例肿瘤患者和10名正常对照者外周血NK细胞表面NKG2A和NKG2D的表达情况。用全自动五分类血液分析仪测定各病例的血常规。结果肿瘤患者和正常对照组白细胞数值差异无统计学意义;肿瘤患者淋巴细胞比率低于对照组,而NK细胞明显高于对照组;肿瘤患者NK细胞表面抑制性受体NKG2A和活化性受体NKG2D均明显高于对照组,但肿瘤患者NKG2D荧光强度呈降低趋势。结论肿瘤患者NK细胞表面NKG2A/NKG2D表达失衡,可能是肿瘤免疫逃逸的机制之一。

NKG2D及其配体在肿瘤免疫中的研究进展

活化性受体NKG2D(natural-killer group 2,member D)及其配体在NK、γδ+T和CD8+T细胞介导的肿瘤免疫应答中扮演了重要角色。深入理解NKG2D及其配体在肿瘤免疫中的作用有助于临床预防和治疗肿瘤。该文阐述了NKG2D的分子结构特性、表达调控及其配体的分类和表达调控;主要介绍了NKG2D及其配体在肿瘤免疫中的作用;最后分析了NKG2D免疫途径中存在的问题和治疗应用前景。

卵巢肿瘤患者外周血NK细胞受体NKG2A、NKG2D及NK活性检测的临床意义

通过研究卵巢癌及良性卵巢肿瘤患者外周血NK细胞表面受体的表达情况及NK活性的变化,分析探讨宿主NK细胞受体与肿瘤免疫逃逸的关系及其临床价值。分离受检者外周血单个核细胞,应用MTT法检测NK细胞的细胞毒活性,流式细胞术检测NK细胞受体NKG2D和NKG2A的表达,并结合临床病理因素作比较分析。结果显示,与良性卵巢肿瘤组和正常组相比,卵巢癌患者外周血NK细胞的细胞毒活性降低,NK细胞表面NKG2D的表达水平降低,而NKG2A的表达水平明显升高,其变化与卵巢癌的病情进展有关。此结果表明,卵巢癌患者机体NK细胞杀伤活性下降,NKG2D与NKG2A二者之间的平衡表达可能对NK细胞的功能状态起着重要的调节作用。

服用扶正抗癌方后非小细胞肺癌晚期患者CD8^+T细胞表达NKG2D和NKG2A受体的变化

目的:探索服用扶正抗癌方后非小细胞肺癌(NSCLC)晚期患者CD8^+T细胞表达NKG2D和NKG2A受体的变化。方法:NSCLC晚期患者共31例,根据不同的临床因素(服用扶正抗癌方前后、病理类型、TNM分期和性别)进行分组,流式细胞术检测外周血CD4^+T、CD8^+T细胞绝对值以及CD8^+T细胞表达NKG2D和NKG2A受体的变化。结果:Ⅲ期患者NKG2D^+NKG2A^-CD8^+T细胞占百分比显著高于Ⅳ期,Ⅲ期患者NKG2D^-NKG2A^+CD8^+T细胞占百分比显著低于Ⅳ期。服用扶正抗癌方后下列指标的变化:NKG2D^+NKG2A^-CD8^+T细胞占百分比显著升高,而NKG2D^-NKG2A^+CD8^+T细胞所占百分比显著降低,而且上述两群细胞所占百分比呈负相关;伴随着CD8^+T细胞表达NKG2D的升高和NKG2A的下降,大部分患者的生存质量稳中有升;鳞癌的NKG2D^+NKG2A^+CD8^+T细胞所占百分比显著低于腺癌;CD8^+T细胞NKG2D和NKG2A的表达无男女差别。结论:服用扶正抗癌方后NSCLC晚期患者CD8^+T细胞表达NKG2D升高NKG2A下降,有助于改善患者的生存质量和预后。

妊娠期uNK、pNK细胞NKG2A与NKG2D的表达及其生物学意义的研究

目的:研究妊娠期妇女子宫NK细胞(uNK细胞)与外周血NK细胞(pNK细胞)表面NKG2A和NKG2D及其相应配体的表达,探讨uNK细胞表面NKG2A和NKG2D的不平衡表达与母胎界面所形成的免疫耐受关系。方法:采用流式细胞术检测30例孕6～9周的正常妊娠妇女uNK细胞和pNK细胞NKG2A、NKG2D的表达状况;RTPCR技术检测绒毛膜组织HLAE、MICA的表达。结果:子宫NK细胞NKG2A的表达显著高于外周血NK细胞,二者分别为(97.86±1.75)%与(33.35±10.92)%;子宫NK细胞NKG2D的表达水平与外周血NK细胞相近,分别为(93.21±4.52)%与(97.80±1.72)%,滋养层组织仅检测到HLAEmRNA的表达。结论:妊娠期子宫NK细胞表面高表达抑制性受体NKG2A,同时滋养层组织表达相应的配体HLAE,这可能是维持母胎界面免疫耐受的重要因素。

NKG2D和NKG2A及相应配体MHC-IA/B和HLA-E在急性白血病的表达及意义

本研究旨在初步探讨NK细胞受体NKG2D和NKG2A在初发ALL和AML患者NK细胞、CD3+T细胞的表达其及相应配体MHC-I A/B和HLA-E在白血病细胞表达差异性和免疫学意义。用流式细胞术检测NK92细胞对8种白血病细胞系的杀伤效率,并检测60例初发急性白血病患者(ALL和AML各30例)骨髓中NKG2D和NKG2A在NK和CD3+T细胞的表达及其相应配体MHC-I A/B和HLA-E在白血病细胞的表达。结果表明,NK92对不同白血病细胞系的杀伤效率存在差异。ALL患者NK细胞和CD3+T细胞的NKG2D及NKG2A阳性表达率与AML患者相比均无显著差异(p>0.05),但是ALL患者白血病细胞MHC-I A/B和HLA-E阳性表达率均明显高于AML患者(p<0.05)。结论:ALL与AML患者免疫细胞功能的差异性可能与白血病细胞配体表达的不同有关,而与本身NK及T细胞表达的杀伤和抑制性受体无关。

食管癌患者外周血NKG2A NKG2D sMICA的表达

我们采用流式细胞术和酶联免疫吸附法（ELISA）分别测定食管癌患者NKG2A、NKG2D及NKG2D可溶性配体sMICA的表达,为食管癌的免疫治疗提供实验依据。

老年肺结核患者外周血NKG2A、NKG2D表达及相关分析

目的了解老年肺结核患者NKG2A、NKG2D表达水平的变化情况,为肺结核免疫治疗提供新思路和理论依据。方法应用流式细胞术分析100例老年初治肺结核患者和89例老年健康体检者外周血中NK细胞表面受体NKG2A、NKG2D表达水平。结果结核组与体检组相比,NKG2D表达明显降低,NKG2A表达明显上调;单纯肺结核患者与肺结核合并肺外结核患者相比,后者NKG2A表达更高(P<0.05);在结核组中,NKG2D表达率随着病灶受累范围增加而明显下降(P<0.05);在菌阴肺结核组与菌阳肺结核组、空洞组与无空洞组之间,NKG2A、NKG2D表达率的差异均无统计学意义(P>0.05)。结论测定老年初治肺结核患者外周血NKG2A、NKG2D,对于了解其机体免疫功能状态、估计病情具有一定临床价值,为免疫治疗提供重要理论依据。