导入NKG5-SV基因增强细胞杀伤活性的研究

目的 :研究免疫效应蛋白NKG5的拼接异构体基因NKG5 SV导入外周血自然杀伤细胞 (NK细胞 )对其杀伤活性的影响。方法 :Percoll细胞分离液分离外周血NK细胞 ,流式细胞仪检测分离后CD5 6阳性细胞浓度。以逆转录病毒为载体将NKG5 SV基因和对照基因LacZ导入NK细胞 ,Northernblot检测NKG5 SV的表达 ,K5 6 2细胞杀伤实验检测病人NK细胞转染NKG5基因前后和正常人NK细胞的NK活性。结果 :Percoll分离后的淋巴细胞CD5 6阳性细胞为 77 44 % ,分离前为 15 88%。病人NK细胞经NKG5 SV基因转染后NKG5 SVmRNA表达增高。病人NK细胞、NK LacZ细胞、NK NKG5 SV细胞和正常人NK细胞对K5 6 2的杀伤活性分别为 5 96 %± 0 38%、6 0 3%± 0 42 % (P >0 0 5 )、2 7 6 7%± 0 18% (P <0 0 1)、30 33%± 0 83%(P <0 0 1)。结论 :免疫效应蛋白基因导入NK细胞 ,可增强NK细胞的杀伤活性。

经不同途径应用 NK-NKG5-SV 细胞防治肝细胞肝癌的研究

目的研究 NKG5-SV 导入肝癌病人 NK 细胞对其抗肝细胞肝癌作用的影响。方法Percoll 不连续密度梯度离心法分离肝癌病人外周血 NK 细胞,以逆转录病毒为载体将 NKG5-SV 基因和报告基因 LacZ 导入 NK 细胞。将不同 NK 细胞与 LCI-D20裸鼠人肝癌同时皮下接种或待 LCI-D20肿瘤成瘤后瘤内注射,观察对肿瘤成瘤和生长的影响。术中经切缘或脾内注射不同的 NK 细胞,观察其对 LCI-D20肝癌切除术后转移复发的影响。结果不同 NK 细胞与 LCI-D20肝癌同时皮下接种 NK-NKG5-SV 细胞组成瘤率、肿瘤直径(cm)均低于 NK-LacZ 细胞组(P 均小于0.01)。肿瘤内注射不同 NK 细胞,NK-NKG5-SV 细胞组的肿瘤生长明显低于 NK-LacZ 细胞组(P 均小于0.05)。肝癌切除术中应用 NK 细胞对照组、NK-LacZ 细胞组、NK-NKG5-SV 细胞组切缘复发瘤直径、肝内转移灶数目、转移灶累及肝叶数、转移灶累及腹内部位数分别为切缘注射:1.51±0.47、0.86±0.49、0.50±0.19(P<0.01),2.60±0.70、1.40±0.54、1.00±1.76,2.40±1.80、O.80±0.54、0.40±1.18,4.20±2.16、1.80±0.13、0.60±0.54(P<0.05)。脾内注射:1.18±0.34、0.86±0.40、0.70±0.35,2.40±1.67、0.60±0.89(P<O.05)、0.40±0.89(P<0.05),2.2±1.09、O.4±O.54(P<0.05)、0.2±0.01(P<0.01),4.60±1.14、1.20±1.70(P<0.01)、0.80±1.09(P<0.01)。结论 NK 细胞具有抑制 LCI-D20肝癌生长及防治肝癌切除术后转移复发的作用。NKG5-SV 基因转染 NK 细胞后可提高 NK 细胞的抗肝癌作用。

NKG5SV裸基因抑制裸鼠体内人肝癌细胞生长及转移

目的 研究NKG5SV裸基因直接注射抗肝细胞肝癌生长及转移复发的作用。方法 以常规方法将NKG划SV装入逆转录病毒载体,扩增捉取NKG5裸基因,以LacZ为对照基因。将不同裸基因和生理盐水与LCI-D20裸鼠人肝癌同时皮下接种或待LCI-D20肿瘤成瘤后瘤内注射,观察对肿瘤成瘤和生长的影响。LCI-D20肿瘤裸鼠皮下接种后10d,分别瘤内注射不同裸基因,观察对肿瘤生长转移的影响。LC1-D20肿瘤肝内接种,接种后22d行肝癌切除术,术中经切缘或脾内注射不同裸基因,观察其对术后转移复发的影响。结累 不同裸基因与LCI-D20肝癌同时皮下接种对照组、LacZ组、NKG5SV组,肿瘤直径(cm)分别为1.76±0.11、1.51±0.34、0.33±0.04。裸基因肿瘤内注射对照组、LacZ细胞组、NKG5SV组,肿瘤直径(cm)分别为0.87±0.08、0.83±0.05、0.26±0.04。瘤重(g)分别为0.43±0.06、0.38±0.04、0.08±0.06。肝癌切除术中应用裸基因转移灶累及部位数、切缘复发瘤直径、肝内转移灶数目、转移灶累及肝叶数在对照组、LacZ组、NKG5SV组分别为,切缘注射肝外转移灶数目(个):4.25±1.48、4.25±1.04、0.63±0.51,切缘肿瘤直径(cm):1.51±0.27、1.35±0.17、0.81±0.17,肝内转移灶数目(个)2.50±1.41、2.38±1.06、1.25±0.71,转移灶累及肝叶数(个):2.13±0.99、2.

人颗粒裂解肽片段在大肠杆菌中的表达

目的:建立颗粒裂解肽(NKG5)的原核表达载体系统,并在大肠杆菌中获得表达。方法:采用寡核苷酸合成、PCR扩增得到NKG5编码序列,克隆到pGEM-T载体上,经测序正确后,再切下编码序列连接到重组表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导重组工程菌表达,采用谷胱甘肽偶联的Sepharose4B纯化重组蛋白。结果:重组菌株可以表达GST-NKG5融合蛋白,用免疫印迹反应鉴定纯化的融合蛋白,在相对分子质量34000处有一条带。结论:获得了在大肠杆菌中低表达的颗粒裂解肽融合蛋白,为后续研究奠定了基础。

人颗粒裂解肽突变子在大肠埃希菌中的构建与表达研究

目的构建NKG5突变基因的原核表达载体并进行表达研究。方法采用寡核苷酸合成的方法,拼接成为NKG5-Ser的编码序列,克隆到pGEMT载体上,测序正确后,再切下编码序列连接到质粒pGEX-4T-1中,重组表达载体转化大肠埃希菌BL21(DE3)pLysS,用IPTG诱导使融合蛋白高效表达。结果成功获得重组表达载体pGEX-4T-1-NKG5-Ser,转染大肠埃希菌BL21(DE3)pLysS,诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹反应均显示显示出相对分子量(Mr)为35 kD的蛋白条带,证明融合蛋白表达成功。结论获得了突变NKG5与GST的融合蛋白,为进一步的工作打下了基础。

NKG_5SV基因导入对自然杀伤细胞杀伤肝癌细胞能力的影响及其机制研究

目的 研究导入NKG5SV基因对NK细胞肝癌杀伤作用的影响及其机理。方法 将NKG5SV和对照基因LacZ基因分别导入肝癌病人的NK细胞 ,K5 6 2细胞杀伤实验检测NK活性 ,MTT法检测不同NK细胞对肝癌细胞株和正常肝细胞株的杀伤 ,并进行形态学观察。DAPI荧光染色法和小片段DNA定量法检测和定量细胞凋亡。结果 肝癌病人NK细胞、NK LacZ细胞、NK NKG5SV细胞 ,健康人NK细胞的NK活性 (% )分别为 5 96± 0 38、6 0 3± 0 42 (P >0 0 5 )、2 7 6 7± 0 18(P <0 0 5 )、30 33± 0 83(P <0 0 5 ) 作用 72h后肝癌病人NK细胞、NK LacZ细胞、NK NKG5SV细胞对SMMC 772 1肝癌细胞株的杀伤活性 (% )分别为 45± 5 ,46± 9(P >0 0 5 )、6 9± 4(P <0 0 1)。SMMC 772 1细胞的凋亡细胞数 (个 /高倍视野 )和凋亡DNA量 (μg/板 )分别为 1 5± 0 3、1 4± 0 5 (P >0 0 5 )、1 9± 0 6 (P >0 0 5 ) ,70± 10、72± 9(P >0 0 5 )、76± 10 (P >0 0 5 )。结论 NKG5SV基因导入肝癌病人的NK细胞通过增加其细胞溶解作用而提高其肿瘤杀伤能力。