IL-21和CCL19修饰可提高NKP30 CAR-T细胞对肺癌的杀伤效率并促进其肿瘤浸润

目的探讨细胞因子IL-21和趋化因子CCL19修饰的NKP30 CAR-T细胞是否增强对肺癌的杀伤和浸润作用。方法在NKP30 CAR基础上融合基因IL-21和CCL19构建IL-21-CCL19 NKP30 CAR;CAR-T细胞的培养使用CD3CD28单抗及细胞因子IL-2刺激;流式细胞术检测免疫细胞表型;迁移实验检测IL-21对免疫细胞的迁移作用;乳酸脱氢酶(LDH)及成球实验检测CAR-T细胞的杀伤及浸润能力;酶联免疫斑点技术(ELISPOT)检测IFN-γ的分泌数量;ELISA检测IL-21及CCL19的分泌情况;体内实验中,将肿瘤细胞显微注射到斑马鱼卵黄囊,构建斑马鱼移植瘤模型,24 h后将免疫细胞注射至同样部位,体式荧光显微镜拍摄荧光。结果NKP30配体(B7H6)在正常组织及血液细胞不表达,在肺癌细胞上高表达(90%以上)。IL-21-CCL19 NKP30 CAR-T细胞与NKP30 CAR-T细胞和常规T细胞相比,具有更强的增殖能力、迁移能力及中心记忆T细胞的形成(P<0.001),免疫抑制分子CTLA4与PD1显著降低(P<0.005),对肺癌细胞具有更强的杀伤能力(P<0.001),伴随IFN-γ数量明显增加(P<0.001)。IL-21-CCL19 CAR-T细胞杀伤肺癌细胞中产生大量细胞因子IL‑21(3152.33±526.74 pg/mL)和趋化因子CCL19(1853±211.95 pg/mL)。体内实验中,CAR-T细胞和普通T细胞比较,具有较强的杀伤能力和增殖能力,但2种CAR-T细胞无明显差异(P>0.05)。结论IL-21-CCL19 NKP30 CAR-T细胞更容易浸润到肿瘤内部,有效杀伤肿瘤细胞,同时产生更多的记忆T细胞。

IRE1α/Xbp1s靶向调控NKp46改善NK细胞杀伤功能清除HIV感染细胞的思路探析

自然杀伤细胞的杀伤活性无MHC限制,不依赖抗体,是抵御肿瘤和病毒感染的第一道防线。肿瘤或慢性病毒感染后,固有免疫NK细胞与适应性免疫T细胞共同发挥免疫功能对抗肿瘤及感染,但由于免疫系统无法迅速根除病灶,免疫细胞内质网稳态被打破,使其无法发挥正常的免疫杀伤及清除功能,导致病情迅速恶化甚至死亡。NKp46是仅表达在NK细胞上的特异性活化受体,它直接影响NK细胞的活化程度与杀伤作用的强弱。艾滋病是一种目前无法根治的慢性传染病之一,病毒持续感染引起NK细胞内质网应激,IRE1α/Xbp1s信号通路的启动导致NKp46蛋白翻译大部分被抑制,影响NK细胞活化发挥功能,因此基于IRE1α/Xbp1s靶向调控NKp46寻求改善NK细胞杀伤功能的新靶点成为研究的新思路。

自身免疫性肝炎患者外周血NKp46^(+)ILC3细胞和Th17细胞变化及其临床意义探讨

目的研究自身免疫性肝炎(AIH)患者外周血NKp46^(+)ILC3细胞和Th17细胞百分比变化及其临床意义.方法2016年2月~2020年2月我院收治的AIH患者43例,使用流式细胞仪检测外周血NKp46^(+)3型天然淋巴样细胞(ILC3)和Th17细胞百分比,应用受试者工作特征曲线(ROC)下面积(AUC)分析应用NKp46^(+)ILC3细胞和Th17细胞百分比判断AIH患者肝组织炎症活动分级的效能.结果10例临床重度AIH患者NKp46^(+)ILC3细胞和Th17细胞百分比分别为(0.2±0.2)%和(1.3±0.4)%,显著低于或高于33例轻中度AIH患者[分别为(0.5±0.2)%和(0.8±0.3)%,P<0.05];12例肝组织G3~4级AIH患者NKp46^(+)ILC3细胞百分比和Th17细胞百分比分别为(0.3±0.2)%和(1.3±0.4)%,显著低于或高于31例G1~2级AIH患者[分别为(0.5±0.2)%和(0.8±0.3)%,P<0.05];以外周血NKp46^(+)ILC3细胞百分比≤0.3%为截断点,判断AIH患者肝组织炎症重度活动的AUC为0.774(95%CI:0.592~0.957),其敏感度为75.0%,特异度为87.1%;以外周血Th17细胞百分比>1.1%为截断点,判断AIH患者肝组织炎症重度活动的AUC为0.853(95%CI:0.734~0.973),其敏感度为66.7%,特异度为90.3%.结论AIH患者外周血NKp46^(+)ILC3细胞水平降低,而Th17细胞水平升高.应用这种变化规律可能有助于判断AIH患者肝组织炎症活动分级,对评估AIH患者病情具有一定的临床意义.

苗药防感香囊对小鼠外周血NKp46表达的影响

目的探讨苗药防感香囊对小鼠固有免疫功能的影响,为苗药防感香囊预防流感提供理论依据。方法 60只昆明种雄性小鼠随机分为6组,每组10只:正常对照组(A组)、正常用药组[持续吸入香囊(B组)]、免疫低下模型组(C组)、模型用药组[间断吸入香囊(D组)、持续吸入香囊(E组)、玉屏风散灌胃(F组)]。预防用药4周后,冷刺激(4℃4 h暴露)3 d制造小鼠免疫低下模型后,取血用于流式细胞仪检测NKp46细胞。结果B组外周血NKp46较A组升高,差异有统计学意义(P<0.05);E组外周血NKp46较C组及D组升高,差异有统计学意义(P<0.05),且与F组相当(P>0.05)。结论持续吸入苗药防感香囊能上调正常小鼠及免疫抑制小鼠外周血NKp46的表达,增强机体固有免疫功能。

不同时期喷施“NKP”对小麦籽粒产量和品质的影响

通过利用新近研制的植物生长调节剂———“NKP”对小麦进行不同时期的叶面喷施,结果表明:喷施“NKP”可以显著提高小麦籽粒的产量、蛋白质含量、蛋白质产量、赖氨酸含量、千粒重、容重,并且以越冬前+拔节后喷施“NKP”对小麦籽粒产量和品质影响最大。

NKp44^+NK细胞通过分泌IL-22介导Stat3信号途径依赖的RA FLS增殖效应

目的探讨类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者NKp44+自然杀伤(natural killer,NK)细胞促成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)增殖的作用机制。方法流式细胞术分选5例RA患者滑液NKp44+NK细胞(5×104/ml),ELISA检测NKp44+NK细胞培养上清IL-22含量。RA FLS加入NKp44+NK细胞培养上清,作用24、48、72 h后MTT法检测FLS增殖。观察不同质量浓度rh IL-22(1 500、3 000 ng/L)促RA FLS增殖作用,检测IL-22抗体及AG490对RA FLS增殖作用影响。RT-PCR检测rh IL-22及AG490作用后RA FLS Stat3 m RNA的表达,Western blot检测RA FLS Stat3、p-Stat3蛋白含量。结果 5例RA滑液NKp44+NK细胞体外分选纯度>90%,培养上清IL-22质量浓度为(1 603.210±332.079)ng/L。NKp44+NK细胞上清可刺激RA FLS增殖(P<0.01)。1 500、3 000 ng/L rh IL-22均能刺激RA FLS增殖。IL-22抗体及AG490能明显抑制NKp44+NK细胞上清诱导的RA FLS增殖(P<0.01)。AG490能抑制rh IL-22诱导的RA FLS Stat3、p-Stat3表达(P<0.05)。结论 RA患者NKp44+NK细胞可分泌IL-22,介导Stat3信号通路刺激RA FLS增殖。

NKp44^+NK细胞在1型糖尿病患者外周血中的表达

目的探讨NKp44+自然杀伤(NK)细胞及其白细胞介素22(IL-22)在1型糖尿病中的表达及可能的临床意义。方法选取湖北省荆州市中心医院19例1型糖尿病患者和20例健康者作为对照组。常规生化指标检查及糖尿病相关慢性并发症筛查,流式细胞仪检测NKp44+NK细胞,酶联免疫吸附测定检测IL-22表达,分析各指标间的相关性及可能影响因素。结果在1型糖尿病患者外周血中NKp44+NK细胞比例及IL-22表达均较对照组升高(P<0.05),NKp44+NK细胞比例与IL-22浓度具有相关性(r=0.513,P=0.025)。NKp44+NK细胞在外周血中比例增加与糖化血红蛋白具有相关性(r=0.465,P=0.045),NKp44+NK细胞比例及IL-22浓度与谷氨酸脱羧酶抗体等指标无相关。无糖尿病周围神经病变组NKp44+NK细胞比例较糖尿病周围神经病变组升高(P<0.05),NKp44+NK细胞比例及IL-22浓度在有无糖尿病下肢动脉病变、糖尿病肾脏病变及糖尿病视网膜病变组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 1型糖尿病患者外周血中NKp44+NK细胞比例及其IL-22表达升高,其可能与1型糖尿病患者血糖控制及糖尿病周围神经病变有关。

NKp30受体在肿瘤和感染性疾病中的研究进展

NK细胞是机体抗感染和抗肿瘤的第一道天然防线,其活性主要受其表面的活化性和抑制性两类受体调控。NKp30作为NK细胞活化性受体,通过与其相应配体结合在对肿瘤和病原体感染细胞的免疫监视及杀伤中发挥着重要的作用。而在一些患者血清中发现高浓度的可溶性配体,这些配体可与NKp30结合,降低NKp30介导的NK细胞杀伤活性。另外,在组织中主要表达NKp30a、b、c三种剪切异构体,三种异构体的表达谱对多种疾病的预后具有潜在的评估价值,并且与疾病的临床症状相关。因此,NKp30可能成为肿瘤和感染性疾病免疫治疗的新靶点及疾病早期评价的新指标。

慢性乙肝患者外周血NK细胞NKp46和NKG2A的表达

目的检测免疫清除期和免疫耐受期慢性乙肝患者外周血中NK细胞频率和NK受体NKp46和NKG2A表达情况。方法分离患者和健康对照者外周血单个核细胞,流式细胞仪检测各组NK细胞频率和受体表达。结果慢性乙肝免疫清除期患者外周血NK细胞占淋巴细胞比例(10.91%±3.93%,n=21)较免疫耐受期患者(15.65%±5.58%,n=15,P=0.024)和健康者(14.23%±7.37%,n=25,P=0.011)下降,免疫清除期患者NK细胞的NKp46表达(45.45%±14.00%,n=19)较免疫耐受期患者(23.35%±6.56%,n=8,P<0.001)和健康者(31.69%±13.07%,n=20,P=0.001)明显上升,NKG2A表达(35.62%±13.20%,n=19)较免疫耐受期患者(25.57%±5.56%,n=8,P=0.038)和健康者(26.80%±10.49%,n=20,P=0.047)上升。结论慢性乙肝患者外周血NK细胞频率下降,NKp46和NKG2A表达上调,这些改变与免疫清除病毒有关。

参芪扶正注射液对肺癌细胞凋亡及NCR1/NKp46通路的影响

目的:探讨参芪扶正注射液对肺癌细胞凋亡及负性调节区域因子1/自然杀伤因子蛋白46(NCR1/NKp46)通路的影响。方法:将人肺癌LEWIS细胞分为LEWIS组、顺铂组、参芪扶正注射液低、高剂量组(低、高剂量组),以上各组每孔设6个平行样。LEWIS组取10 mL肺癌LEWIS细胞液(细胞浓度为5×10^6/mL)于10%胎牛血清的DMEM培养液中;顺铂组细胞培养方法同LEWIS组,加入顺铂使终浓度为50.0μg/mL;低、高剂量组细胞培养方法同LEWIS组,分别加入参芪扶正注射液,使终浓度为50.0μg/mL、100.0μg/mL,培养72 h。培养结束后,MTT法测定各组细胞活力,结晶紫染色测定单克隆形成数目,膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡水平,RT-PCR法及Western blot法测定NCR1、NKp46基因与蛋白表达水平。结果:与LEWIS组比较,顺铂组与低、高剂量组细胞OD值、存活率、克隆形成数目降低,凋亡率、G1期水平及NCR1、NKp46 mRNA和蛋白表达升高(P<0.05)。与顺铂组比较,低剂量组细胞OD值、存活率、克隆形成数目升高,凋亡率、G1期水平及NCR1、NKp46 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05);高剂量组细胞OD值、存活率、克隆形成数目降低,凋亡率、G1期水平及NCR1、NKp46 mRNA和蛋白表达升高(P<0.05)。与低剂量组比较,高剂量组OD值、存活率、细胞克隆形成数目降低(P<0.05),凋亡率、G1期水平及细胞NCR1、NKp46 mRNA和蛋白表达均升高(P<0.05)。结论:参芪扶正注射液能抑制人肺癌LEWIS细胞增殖,促进其凋亡;其机制与参芪扶正注射液可促进肺癌LEWIS细胞NCR1、NKp46 mRNA与蛋白高表达,进而介导NK细胞杀伤肺癌细胞有关。

NK细胞受体NKp46的研究进展

NKp46是最主要的自然细胞毒受体,在自然杀伤作用中起关键作用,选择性地表达在静息和活化的NK细胞上,其显著特征是以HLA I类分子非依赖方式诱导NK细胞活化直接杀伤靶细胞。NKp46是近年来免疫学领域研究的热点之一。本文介绍NKp46的分子结构和生物学功能的研究进展。

芪术抗癌方对肝癌NKp46表达水平的影响

目的:研究芪术抗癌方对肝癌NKp46表达水平的影响,探讨芪术抗癌方激活自然杀伤(NK)细胞的分子机制。方法:HepG2细胞小鼠肝内注射构建肝癌小鼠模型,随机分为模型组(5只)、治疗组(低剂量组、中剂量组、高剂量组各5只);空白组(4只,未建模)。治疗组给予芪术抗癌方灌胃,空白组和模型组给予0.9%氯化钠注射液灌胃,治疗4周后麻醉采血处死,留取肝脏标本,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、Western blot蛋白印迹、免疫组织化学染色等技术检测肝癌细胞中NKp46的表达水平。结果:RT-PCR检测结果显示,空白组、治疗组NK细胞、NKp46表达均高于模型组,模型组与空白组的NK细胞表达差异具有统计学意义(P<0.05),低剂量组、中剂量组与模型组的NK细胞表达差异具有统计学意义(P<0.01);模型组与空白组NKp46表达水平差异具有统计学意义(P<0.01),低剂量组与模型组比较NKp46表达水平差异具有统计学意义(P<0.05);免疫组化和Western blot蛋白印迹结果显示,治疗组较模型组NKp46的表达增强。结果:芪术抗癌方可以增加肝癌NKp46的表达,激活NK细胞,提高NK细胞的细胞毒作用。

人NKp46基因克隆及其在大肠杆菌中的表达和纯化

目的:对人NKp46进行基因克隆并探讨其在大肠杆菌中重组表达和纯化。方法:用RT-PCR法自人外周血单个核细胞总RNA扩增hNKp46片段(约900 bp),克隆至质粒载体pMD18-T,并对克隆的DNA片段进行序列分析。用限制酶EcoRⅠ和NcoⅠ消化pMD18-T-hNKp46重组质粒,分离hNKp46片段,并插入原核表达载体pET30a(+)的相应限制酶位点,酶谱分析鉴定重组表达载体pET30a(+)-hNKp46。转化菌株BL21(DE3)经IPTG诱导,用SDS-PAGE和Western Blotting鉴定表达的重组蛋白。采用His.BindPurification Kit对重组蛋白进行纯化。结果:RT-PCR扩增的DNA片段与hNKp46 cDNA大小一致。重组质粒pMD18-T-hNKp46的DNA序列分析显示,克隆的DNA序列与文献报道的hNKp46的cDNA序列一致。SDS-PAGE表明,重组蛋白相对分子质量为38.5 kD,其表达量达菌体总蛋白的40%左右。Western Blotting分析显示,重组蛋白能特异地与抗His.Tag抗体结合。纯化得到纯度为95.5%的重组蛋白,纯化回收率达40%。结论:成功构建了人NKp46表达载体,并获得了稳定表达的工程菌株,纯化了重组蛋白。

自然杀伤细胞表面NKp30受体的研究进展

自然杀伤细胞(NK cells)是机体的固有免疫细胞,参与了病毒感染细胞和肿瘤的清除。NK细胞的活化受其表面活化性受体和抑制性受体的共同调控;而NKp30是其膜表面一类重要的活化性受体自然细胞毒性受体的一种。多项研究结果表明NKp30参与了自然杀伤细胞抗肿瘤及抗病毒感染的免疫过程,并在其中发挥了重要的作用。该文就自然杀伤细胞表面NKp30受体的研究进展进行综述。

不同浓度“NKP”对小麦籽粒产量和品质的影响

通过利用新近研制的植物生长调节剂——“NKP”对小麦进行不同浓度的叶面喷施,结果表明:喷施“NKP”可以显著提高小麦籽粒的产量和品质,并且以每1500mL“NKP”原液+750kg/hm2的水,对提高小麦籽粒产量和品质影响最大。

消费者洞察的NKP模型:社会网络分析在智能广告中的应用

在大数据和人工智能的赋能下,互联网广告的全样本消费者洞察具有了技术可能性。每一个广告活动都要面对数以亿、千万,至少百万计规模的消费者,对所有消费者进行洞察需要庞大的数据、高昂的费用、较长的时间。在这种背景下,准确、高效、经济的消费者洞察成为关键。

急性白血病儿童NK细胞受体NKG2D、NKp46及KIR2DL1表达率

目的研究急性白血病儿童NK细胞受体NKG2D、NKp46及KIR2DL1表达率。方法选取2016年3月至2017年6月本院收治的急性白血病患儿58例,其中急性淋巴细胞白血病患者45例、急性粒细胞白血病患者13例。按照治疗时间不同将患儿分成新发组及正常组,每组29例,分析两组患儿NK细胞受体NKG2D、NKp46及KIR2DL1表达率。结果新发组NKG20表达率为(79.56±11.46)%,正常组NKG20表达率为(92.36±3.25)%,组间比较差异无统计学意义(P >0.05)。新发组NKp46表达率为(61.56±11.32)%,正常组NKp46表达率为(79.26±4.52)%,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。新发组KIR2DL1表达率为(19.85±3.54)%,正常组KIR2DL1表达率为(12.87±1.75)%,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。新发组与正常组患儿NK细胞数量及活性比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论随着治疗的进行患儿NKG2D、NKp46及KIR2DL1表达率可逐渐恢复,提示机体NK细胞的免疫能力逐渐提升。

自然杀伤细胞表面受体NKp46的研究进展

一、自然杀伤细胞(natural killer cells,NK细胞)简介NK细胞来源于骨髓的淋巴细胞,是机体抵抗病毒感染和防止肿瘤发生的第一道防线,与T细胞不同,NK细胞无需抗原的刺激即可杀伤靶细胞。NK细胞表面活化性受体和抑制性受体的平衡调控NK细胞的活性[1]。NK细胞表面受体包含在免疫球蛋白超家族(immunogloblin gene superfamily,IgSF)或细胞毒性T淋巴细胞受体(cytotoxic T lymphocytes receptor,CTLR)

自然杀伤细胞表面受体NKp30的研究进展

自然杀伤（NK）细胞无需预先致敏即可快速杀伤靶细胞，是机体发挥抗肿瘤免疫和抗感染免疫的重要执行者。NK细胞的活化与否取决于细胞表面活化性受体和抑制性受体信号的平衡。NKp30是NK细胞表面的一种重要的活化性受体，可接收相应配体如BAG-6、B7-H6等分子信号进而激活NK细胞，发挥抗肿瘤和抗感染免疫作用。同时NKp30也是肿瘤细胞和病原体发生免疫逃逸的重要靶点，可通过多种机制逃逸NK细胞杀伤。此外，NKp30还参与了NK细胞和树突状细胞（DCs）间的双向免疫调节。

新型NKp30 CAR-T细胞的构建及其对HGC27胃癌细胞杀伤作用的研究

本研究通过构建携带以NKp30为基础的嵌合抗原受体(CAR)的慢病毒载体,利用第三代慢病毒质粒表达系统在HEK-293T细胞中包装获得慢病毒,并在Jurkat细胞中检测慢病毒滴度达7.6×10^(6)U/m L。然后,转染人外周血T细胞,制备NKp30 CAR-T细胞,利用流式细胞术检测CAR的转导效率约为71.9%,分别利用7-AAD法、ELISA法和CFSE法检测其对胃癌细胞系杀伤效率、干扰素-γ的分泌水平以及增殖能力的影响,并通过流式细胞术检测NKp30 CAR-T细胞的分子标志物。结果显示,NKp30CAR-T细胞对表达B7-H6分子的HGC27胃癌细胞系具有显著的杀伤作用,杀伤效率明显高于T细胞对照组(P<0.05),但对MKN74和AGS细胞系的杀伤效率与T细胞对照组无统计学差异(P>0.05);与HGC27细胞共培养后,NKp30 CAR-T细胞分泌干扰素-γ的水平和增殖能力明显高于T细胞对照组(P<0.05)。流式细胞术结果显示,大部分NKp30 CAR-T细胞的表型为中央记忆性T细胞。通过本研究获得的NKp30CAR-T细胞可通过NKp30受体识别并杀伤胃癌靶细胞。