CD11c和NLDC-145单克隆抗体标记的阳性细胞的观察

目的 探讨CD11c和NLDC14 5单克隆抗体标记胸腺内何种间质细胞 ,并是否具有特异性。 方法 应用CD11c单克隆抗体及NLDC 14 5单克隆进行标记 ,采用免疫荧光双重染色法及免疫电镜法对胸腺内间质细胞进行观察。 结果 CD11c阳性细胞为指状嵌入突起细胞 (interdigitatingcell,IDC)及少数巨噬细胞。NLDC 14 5阳性细胞为胸腺上皮细胞。 结论 CD11c标记IDC ,NLDC 14 5标记胸腺上皮细胞。胸腺巨噬细胞中存在不同亚群。

血清miR-145、P53抗体在龙贝逍遥散治疗乳腺癌效果及预后评估中的检测价值研究

【目的】探析血清微小核糖核酸-145(miR-145)、P53抗体在龙贝逍遥散治疗乳腺癌效果及预后评估中的检测价值。【方法】选取2020年1月~2021年1月北京航天总医院收治的90例乳腺癌患者作为研究对象,采用随机数字表法将患者随机分为观察组和对照组,每组各45例,2组患者均接受个性化综合治疗,观察组在此基础上联合龙贝逍遥散治疗,疗程为3个月。采用实时荧光定量(PCR)法检测血清miR-145表达水平,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清P53抗体表达水平。比较2组患者治疗前后的血清miR-145、P53抗体表达水平差异,采用Logistic回归分析法探析血清miR-145、P53抗体与观察组患者预后不良的关系,绘制受试者工作特征(ROC)曲线,分析血清miR-145、P53抗体在观察组预后不良预测中的应用价值。【结果】(1)治疗后,2组患者的血清miR-145检测值均呈上升趋势(P<0.05),P53抗体检测值均呈下降趋势(P<0.05),且观察组的血清miR-145检测值明显高于对照组,P53抗体检测值明显低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。(2)观察组预后良好组的血清miR-145检测值明显高于预后不良组,血清P53抗体检测值明显低于预后不良组,差异均有统计学意义(P<0.05)。(3)Logistic回归分析结果显示,miR-145高表达是观察组患者预后不良的保护因素,P53抗体高表达是观察组患者预后不良的危险因素(P<0.05)。(4)血清miR-145、P53抗体联合预测观察组患者预后情况的曲线下面积(AUC)最大(0.877,95%CI:0.769~0.985),其灵敏度、特异度分别为93.75%、93.10%,差异有统计学意义(P<0.05)。【结论】血清miR-145在乳腺癌预后不良中呈低表达,血清P53抗体在乳腺癌预后不良中呈高表达;龙贝逍遥散在乳腺癌患者中可达到较理想的治疗效果,有利于提升血清miR-145表达水平、降低血清P53抗体表达水平。

抗SMO多克隆抗体对DU145前列腺癌细胞生长及侵袭力的影响

目的探讨抗SMO多克隆抗体对DU145前列腺癌细胞生长及侵袭能力的影响。方法预测SMO蛋白抗原表位并制备SMO抗体,评估其效价和特异性;实验分组包括空白对照组、兔IgG抗体处理组、抗SMO抗体处理组、shRNA空载对照组、TRPC-6蛋白shRNA稳转细胞处理组以及合并正常IgG抗体和抗SMO抗体处理组。MTT法和细胞凋亡实验检测抗SMO抗体对DU145细胞增殖和细胞凋亡的影响;Transwell实验检测抗SMO抗体对正常以及稳转TRPC-6shRNA蛋白的DU145细胞侵袭能力的影响。结果制备的抗体效价为1∶51 200,且抗体特异性良好;随着抗SMO抗体浓度的升高,细胞存活百分比逐渐下降(P<0.05),随着时间的发展,48 h和72 h之间的细胞存活百分比存在差异(P<0.05)。凋亡实验显示,早期凋亡细胞(Annexin V+/PI-)凋亡百分比在抗SMO抗体处理组较空白对照组中明显升高(P<0.05),随着抗体浓度的升高,凋亡百分比逐渐升高。Transwell实验显示,随着抗SMO抗体的处理,细胞的细胞侵袭抑制率逐渐升高(P<0.05),TRPC-6蛋白shRNA稳转DU145细胞处理组中,随着抗体浓度的升高,细胞的细胞侵袭抑制率逐渐升高(P<0.05)。结论抗SMO多克隆抗体对正常以及TRPC-6蛋白shRNA稳转的DU145细胞生长以及侵袭能力均有明显的抑制作用,为临床治疗前列腺癌提供一个潜在的方向。

乙肝病毒表面抗原G145R变异单克隆抗体的制备及其初步鉴定

目的：研制抗乙肝病毒G145R变异表面抗原的单克隆抗体（mAb）。方法：将重组乙肝病毒G145R变异表面抗原以Al（OH）3佐剂化,常规免疫BALB/c小鼠,采用细胞融合技术制备抗乙肝病毒G145R变异表面抗原的mAb。采用ELISA对制备物的效价与特异性进行鉴定,将其用于部分临床标本的检测,并与德国抗HBs mAb GL2.001进行比较。结果：获得1株稳定分泌抗G145R HBs mAb的杂交瘤细胞,命名为4-E12。该细胞株染色体数目为90条,所分泌mAb属IgG1亚类。其培养上清与腹水抗G145R HBs ELISA效价为（0.5-1）×10^3及（1-10）×10^6。经持续3月培养,低血清适应以及反复冻存与复苏后,其细胞增殖能力与上清抗G145R HBs效价与克隆化结束时大致相似。将其与德国抗G145R HBs mAb GL2.001相比,二者对重组乙肝表面抗原G145R变异S蛋白的反应性大致相当,灵敏度前者稍低于后者（分别为2.0μg/L与1.0μg/L）。对野生株表面抗原的检测前者在实验浓度范围内未显示有意义的反应信号,后者在与高浓度（1mg/L及以上）抗原反应时S/N值达到或高于3.9。将二者用于对一组特定患者的临床检测,其阳性率前者（17/200,8.5%）较后者（11.5%）略低,其差别经统计学比较无统计学意义（P〉0.05）。结论：成功地制备了1株抗乙肝表面抗原G145R变异体的mAb,为乙肝G145R变异的基础、临床与流行病学研究提供了进一步的物质基础。

非洲猪瘟病毒K145R蛋白的原核表达及其单克隆抗体制备

为研发非洲猪瘟病毒(ASFV)的免疫诊断学试剂,利用大肠杆菌系统表达ASFV重组K145R蛋白,制备并鉴定K145R蛋白单克隆抗体。结果显示,成功构建pET28a-K145R表达载体,表达得到大小约为17 ku可溶性的重组K145R蛋白。Western blot分析证实,重组K145R蛋白与ASFV阳性血清有良好的反应性。经细胞融合、筛选,得到单克隆抗体1D4;ELISA检测其效价为1∶5120000;亚类鉴定其重链为IgG2a,轻链为κ;Western blot鉴定其能特异性识别重组K145R蛋白;IFA检测其能与ASFV反应。综上,实现K145R蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达并制备单克隆抗体。

牛轮状病毒多克隆抗体制备及特性分析

旨在优化G6P[1]型牛轮状病毒(bovine rotavirus, BRV)在MARC-145细胞中的培养条件,制备其兔源多克隆抗体,并对制备的多抗进行效价检测及鉴定。对G6P[1]型BRV毒株NCDV进行不同病毒接种量及收毒时间优化,确定病毒在MARC-145细胞中的最佳培养条件;以1×10^(7) TCID_(50) NCDV活毒作为免疫原免疫成年兔,制备兔源多克隆抗体;通过间接ELISA检测多抗效价,并通过间接免疫荧光试验(IFA)及中和试验鉴定其特异性。结果:NCDV毒株以感染比0.1、感染时间24 h为最佳培养条件,病毒滴度可至4.9×10^(6) TCID_(50)/mL;间接ELISA结果显示,多克隆抗体的效价为1∶51 200,表明NCDV具有良好的免疫原性;IFA及中和试验结果表明,NCDV多克隆抗体与G6P[1]型、G9P[1]型和G10P[11]型BRV毒株均能发生特异性反应,存在良好的交叉中和效应,表明制备的多抗具有良好的反应性。综上,本试验成功优化了NCDV毒株在MARC-145细胞中的增殖条件,并制备了高效价的兔源多克隆抗体,为后续BRV感染的血清学诊断及疫苗研发奠定了理论基础。

非洲猪瘟病毒pK145R蛋白的原核表达及抗血清的制备

为制备兔抗ASFV pK145R蛋白的多克隆抗体,本研究以中国首次分离的ASFV HLJ/18毒株K145R基因的真核表达质粒p CAGGS-Flag-K145R为模板扩增K145R基因,构建重组原核表达质粒p ET-21a-K145R,利用镍亲和层析预装柱纯化p K145R蛋白并免疫新西兰大白兔,制备兔抗ASFV pK145R蛋白多克隆抗体,并通过免疫印迹(WB)、间接免疫荧光(IFA)及免疫沉淀(IP)试验对该抗体进行验证。结果显示:本研究成功构建了原核表达质粒p ET-21a-K145R,将该质粒转化细菌BL21(DE3)获得能够可溶性表达p K145R蛋白的重组菌,分子量约为16.0 kDa;利用高度纯化的ASFV pK145R蛋白,制备了兔抗ASFV pK145R蛋白的多克隆抗体,该抗体能够特异性地识别HEK293T细胞中瞬时表达的Flag-K145R蛋白和ASFV感染猪肺泡巨噬细胞中表达的ASFV K145R蛋白。本实验为深入研究p K145R蛋白的功能及其在ASFV感染致病性中的作用奠定了基础。

G145R突变后HBsAg“a”决定簇合成肽的免疫学特性分析

目的研究G145R突变后乙肝表面抗原(HBsAg)“a”决定簇合成肽的免疫学特性改变情况。方法首先合成2条短肽P1wt和P2145R,分别代表野毒株和G145R突变后HBsAg“a”决定簇合成肽。然后用β巯基乙醇(2ME)变性试验以及用乙肝疫苗标准品制备的小鼠多抗血清研究2条合成肽的空间构象以及抗原性异同。最后用等量合成肽免疫小鼠,用酶免疫法、竞争抑制试验和Westernblot试验等研究G145R突变后“a”决定簇合成肽的免疫原性改变。结果合成肽P1wt和P2145R用2ME温和变性后,PAGE结果表现为相对分子质量(Mr)为4×103左右的单一条带,而变性前2条合成肽均表现为Mr是从4×103到30×103的弥漫条带,主带位置在5×103和10×103,分别相当于二聚体和四聚体位置;用HBsAg的多克隆抗体(antiHBs)检测合成肽的抗原性,结果在固定抗原量的前提下,在抗体1∶32000稀释时仍可检测到P1wt的阳性结果,而当同一抗体稀释到1∶8000时,P2145R检测结果即为阴性。合成肽P2145R免疫小鼠产生的抗体与P1wt合成肽的反应滴度比与P2145R合成肽本身的反应低4～8倍。结论针对HBsAg“a”决定簇合成肽可自发形成一定的空间构象,G145R突变株的HBsAg“a”决定簇的抗原性和免疫原性与野毒株相比发生了明显改变,为正确评价G145R变异株的流行危害以及现行疫苗的保护效果提供了实验依据。

全人源抗前列腺癌ScFv抗体的筛选及生物学特性研究

目的从已成功建立的前列腺癌噬菌体抗体库中筛选抗人前列腺癌单链抗体(ScFv),并分析其生物学特性。方法以良性前列腺增生(BPH)细胞与噬菌体抗体库共孵育,去除抗体库中能够与BPH细胞结合的噬菌体抗体,再以前列腺癌细胞系DU145与去除非特异性结合后的噬菌体抗体库共孵育,通过"吸附-洗脱-扩增"对前列腺癌的噬菌体抗体库进行3轮的富集。采用流式细胞术筛选出对人前列腺癌细胞系DU145高亲合力的阳性克隆。阳性噬菌体克隆经亚克隆并转染大肠杆菌TG1,表达出可溶性ScFv抗体。采用流式细胞术、免疫荧光法分析其生物学特性。结果以前列腺癌细胞系DU145为抗原,筛选出19个噬菌体抗体,经测定C11与DU145细胞亲合力最高,亚克隆至原核表达载体表达纯化为C11 ScFv抗体。流式细胞术和免疫荧光法检测结果均显示,C11ScFv抗体与前列腺癌细胞DU145和PC3结合,与BPH细胞不结合。结论通过噬菌体展示技术筛选到前列腺癌细胞系高亲合力的可溶性ScFv抗体,为进一步研究抗体的靶向性治疗奠定了基础。