枳NLP转录因子克隆及其在不同水分条件下的表达

【目的】分析柑橘砧木枳(Poncirus trifoliata(L.)Raf.)参与氮素吸收与同化的重要转录因子NLP在干旱胁迫下的表达模式,为柑橘在干旱胁迫条件下对氮素吸收与同化的调控机理提供研究参考。【方法】以柑橘砧木枳为试验材料,在甜橙(Citrus sinensis(L.)Osb.)基因组数据库的基础上,利用生物信息学筛选获得甜橙NLP,并以此设计引物扩增枳NLP的CDS全长并测序。利用Clustal X和MEGA程序进行序列比对和系统发育分析,利用实时荧光定量PCR技术分析不同水分条件下的枳NLP的表达模式。【结果】筛选并克隆获得了4条枳NLP序列,为Pt NLP2、Pt NLP4、Pt NLP7和Pt NLP8。序列比对分析表明枳NLP之间的蛋白质序列一致性为45.13%,均具有明显的RWP-RK和PB1结构域。枳与甜橙的NLP蛋白质序列的一致性极高,分别为97.57%、96.47%、99.0%及97.33%。系统发育分析表明枳NLP可分为4个进化类型,与拟南芥的NLP分类一致,即Pt NLP2与At NLP1/2一类,Pt NLP4与At NLP4/5一类,Pt NLP7与At NLP6/7一类,Pt NLP8与At NLP8/9一类。在不同水分条件下,枳NLP的表达模式在叶与根中存在差异。随着基质水分含量的减少,枳叶NLP呈现先上升再下降的趋势。与对照(相对持水量为61.0%)相比,叶Pt NLP2、Pt NLP4、Pt NLP7及Pt NLP8的表达量在相对持水量为15.4%时上调至最高水平,分别上调了2.9、3.5、5.9及2.8倍,之后持续下调;到相对持水量为9.4%时,其表达水平低于对照但无显著差异。而枳根NLP的表达量在对照中最高,后随着水分的散失呈总体下降趋势且差异显著,与对照相比,根Pt NLP2、Pt NLP4、Pt NLP7及Pt NLP8的最大下调倍数分别为6.7、2.8、4.8及2.3。复水后,枳叶与根NLP的表达量低于复水前,且与对照差异显著。【结论】枳NLP的表达与土壤的水分条件密切相关。枳叶片NLP的表达水平在干旱胁迫前、中期上调,后期下调;而枳根NLP的表达水平在干旱胁迫下持续下调。其中,Pt NLP2和Pt NLP7的表达量在枳根响应干旱胁迫中变化较大。

藜麦NLP转录因子家族的鉴定及表达分析

NLP转录因子是植物特有的一类转录因子家族,在植物氮素吸收、转运和同化过程中发挥重要作用。为了解NLP基因在藜麦中的全基因组特征和表达模式,利用生物信息学方法在藜麦基因组中鉴定出9个藜麦NLP基因家族成员,并对其理化性质、染色体定位、基因结构、蛋白保守结构域、保守基序、系统进化以及在不同氮素水平处理下的表达模式进行了分析。结果表明,藜麦9个NLP基因分布于7条染色体上;每个成员含有4~5个外显子、3~4个内含子以及上游非翻译区;启动子中包含有大量激素和胁迫响应的顺式作用元件,其中,在CqNLP3和CqNLP4的启动子区域均预测到1个氮素响应元件GCN4。藜麦NLP蛋白长718~952个氨基酸,分子质量为80.48~104.86 ku,等电点5.31~6.50;每个成员都含有RWP-RK和PB1共2个保守结构域,其在蛋白中的位置具有很高的相似性,保守基序的分析进一步证实了这2个结构域的保守性。系统进化分析表明,9个藜麦NLP家族成员可分为ClassⅠ,ClassⅡ和ClassⅢ共3组,其在进化关系上与拟南芥的亲缘关系更近。在缺氮条件下,CqNLP2、CqNLP3、CqNLP5和CqNLP8表达受到抑制,低氮下则诱导表达;低氮处理后期,CqNLP9的表达量急剧增加。荧光定量PCR表达趋势与转录组数据一致。研究结果可为后续CqNLPs基因克隆和氮素胁迫分析提供参考依据。

毛竹NLP转录因子鉴定及其响应氮素的表达模式

[目的]鉴定毛竹中NLP家族成员,为深入研究毛竹NLP分子调控机制奠定基础。[方法]采用生物信息学方法鉴定并系统分析毛竹NLP成员的分子特征,用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测毛竹NLP响应氮素的表达模式。[结果]毛竹中鉴定出10个NLP成员(PeNLP1~PeNLP10),其蛋白长度为714~963 aa,分子量为77.41~105.08 kDa,理论等电点介于5.36~6.25之间;亚细胞定位预测结果表明,除PeNLP9定位于叶绿体外,其余成员均定位于细胞核内。系统进化分析表明:PeNLPs分成3个组,各组成员分别为4、2、4个。PeNLPs均包含4个内含子,不同成员内含子的大小和位置存在一定的差异;PeNLPs内有共线性基因对6个,PeNLPs和OsNLPs之间有共线性基因对9个,且它们的Ka/Ks均小于1,说明其在进化上经历了纯化选择。组织特异性分析表明,有的PeNLPs呈组织特异性表达,有的则呈组成型表达。PeNLPs受到氮饥饿诱导表达,在1 h内PeNLP1的表达量显著上调,其它5个PeNLPs则显著下调(p<0.01);对氮饥饿72 h后的毛竹进行复氮处理,在24 h内所有PeNLPs的表达量均显著或极显著上调(p<0.05或p<0.01)。[结论]毛竹中NLP家族有10个成员,各成员的分子特征和组织表达特异性存在一定的差异,PeNLPs的表达能够对氮饥饿作出快速响应,且在氮饥饿后复氮过程中显著上调表达,响应氮素的诱导。

枳NLP转录因子响应干旱胁迫并与NRE顺式作用元件互作

【目的】探讨枳氮素含量在干旱条件下的变化,以及氮代谢途径枳亚硝酸还原酶基因(NiR)和NLP转录因子的响应表达,分析确定枳NLP转录因子与NiR启动子区域硝酸盐响应顺式作用元件(nitrate-responsive cis-element,NRE)位点绑定互作。【方法】以一年生的砧木枳为试验材料,进行干旱处理直至植株叶片开始萎蔫,并设置对照。利用凯氏定氮仪检测干旱条件下枳叶片和侧根的全氮含量,并同步利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和2-ΔΔCT法分析PtNiR、PtNLP2、PtNLP4、PtNLP7及PtNLP8在枳叶片和侧根的表达情况。通过基因克隆并检索与比对分析,获取PtNiR启动子区域的硝酸盐响应顺式作用元件序列,之后利用同源克隆方法构建用于酵母单杂交的pHIS2-4×NRE和p GADT7-Rec-NLP载体,将构建的pHIS2-4×NRE和p GADT7-Rec-NLP载体质粒共同转化到酵母菌株Y187中,在氨基酸缺失培养基(SD/-Trp/-Leu,以及SD/-His/-Trp/-Leu/+120 mmol·L^(-1) 3-氨基三唑)上30℃恒温培养3—5 d,观察酵母的生长情况,以确定枳NLP转录因子(PtNLP2、PtNLP4、PtNLP7及PtNLP8)与NRE的互作关系。【结果】受干旱的影响,枳叶片全氮含量表现出先升高再下降的趋势,而侧根中全氮含量则显著下降;在对照中,枳叶片和侧根全氮含量均显著上升。RT-qPCR分析表明,PtNiR的表达水平在叶片中先上调然后再显著下调,而在侧根中则随着干旱程度的增加显著下调;PtNLP2、PtNLP4及PtNLP7在枳叶片和侧根中的表达也均呈现不同程度的先上调然后再受到抑制的规律,而PtNLP8在枳叶片和侧根中的表达则在一定程度上受到干旱抑制。通过克隆测序分析,在枳NiR启动子区域-196至-154的位置发现了疑似NRE。酵母单杂交分析表明,转化pHIS2-4×NRE-HIS3载体和p GADT7-Rec-NLP载体的Y187酵母在对照培养基(-Trp/-Leu)和含有120 mmol·L^(-1) 3-氨基三唑的三缺培养基(-His/-Trp/-Leu)上均能正常生长。【结论】枳侧根中的全氮含量受干旱的影响而显著下降,以对照为参比,枳侧根和叶片中的全氮含量均随着干旱时间的延长而相对减少。氮代谢途径的枳NiR和NLP转录因子在叶片和侧根中的表达对干旱有不同程度的响应。PtNLP2、PtNLP4、PtNLP7及PtNLP8转录因子均能与PtNiR启动子中的硝酸盐响应顺式作用元件(NRE)位点绑定互作,从而激活下游基因的表达。

植物NLP转录因子研究进展

转录因子NLP(NIN-like protein)是近年来发现的具有调控养分吸收和植物生长发育、响应外界环境胁迫等功能的植物特异性转录因子。本文对近年来有关NLP家族的最新研究成果进行了总结,综述了植物NLP家族的结构和分类、对氮磷养分信号通路的调控、参与植物生长发育过程以及胁迫应答方面的研究进展,并展望了NLP的可能研究热点和领域,以期为后续研究提供参考。

‘海尔特兹’红树莓果实发育过程中NLPs(NIN-like proteins)转录因子家族的生物信息学分析

为探究‘海尔特兹’红树莓中NLPs(NIN-like proteins)转录因子家族成员的基本特征和表达模式,本研究利用生物信息学技术对‘海尔特兹’红树莓4个发育时期(青果、黄果、红果、深红果)果实的NLP基因家族成员进行分析。结果表明:红树莓中3个NLPs转录因子都含有RWP-RK结构域,其中RuNLP1和RuNLP2的保守基序相同;红树莓的NLPs转录因子家族成员与野草莓和月季的NLPs转录因子家族进化关系最近,且NLPs基因家族的基因扩增发生在单子叶植物和双子叶植物祖先分化之前;RuNLP1和RuNLP2为酸性不稳定的亲水性蛋白质,而RuNLP3为碱性不稳定的亲水性蛋白质;三者都不含信号肽和跨膜结构;RuNLP1和RuNLP2蛋白质均定位于细胞核,而RuNLP3定位于细胞核和叶绿体;二级结构的预测结果显示,结构占比均以无规卷曲为主,α螺旋次之,与三级结构预测结果基本一致,结果较为可靠;RuNLPs转录因子家族成员之间不存在互作现象;RuNLPs基因家族3个成员的表达量随果实逐渐成熟均减少。本研究为RuNLPs转录因子家族在红树莓果实发育过程中的分子机制提供了理论基础。

苹果NLP(Nin-Like Protein)转录因子基因家族全基因组鉴定及表达模式分析

【目的】探究苹果NLP转录因子全基因组特征与表达模式,以便更深入地了解其结构特点与作用机制。【方法】基于本地BLAST数据库和Pfam数据库两大数据库,运用blastp和hmmsearch两种查询策略,对苹果全基因组范围内的NLP转录因子家族成员进行鉴定。经过严格筛选与确认后,对搜索结果进一步展开分析,主要分为3部分,包括NLP蛋白分析、NLP分析与苹果NLP表达分析,其中ProtParam、Clustal Omega、MEGA7、MEME 5.0.2、SOPMA、Phyre2、WoLF PSORT、STRING等程序或软件用于蛋白质分析,基因分析使用MG2C、GSDS 2.0、PlantCARE、psRNATarget等在线工具,对于苹果NLP表达情况利用qRT-PCR进行定量检测。【结果】从苹果全部蛋白数据库中共筛选出6个NLP成员,系统进化分析可将它们分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三类;蛋白二级结构以无规则卷曲为主,其次是α-螺旋,占比最小的是β-转角;亚细胞定位预测均定位于细胞核中,符合转录因子的特征;染色体定位显示5个基因(MDP0000584547除外)定位于4条染色体上;启动子分析发现大量与激素和逆境响应相关的顺式作用元件,暗示它们可能参与到激素和逆境信号的调控过程中,此外还识别到一个响应氮的GCN4作用元件,进一步说明该类转录因子与氮素有密不可分的关系;通过定量检测揭示苹果NLP家族在茎、叶等组织高表达的特征模式,并且表达分析结果也证实苹果NLP响应氮饥饿、干旱胁迫等。【结论】通过对苹果全基因组的分析,共识别6个NLP转录因子,对6个基因的结构与蛋白保守域分析,发现它们之间具有极高的相似性、保守性,同时又存在差异。类比拟南芥NLP蛋白的关联网络,推测与拟南芥NLP7同源性最高的MDP0000132856可能也具有复杂的功能。

棉花NLP(NIN-Like Protein)基因家族的全基因组鉴定及表达分析

【目的】全基因组范围内探究棉花NLP转录因子的结构特点及进化特征,深入了解棉花NLP转录因子表达模式,为后续NLP的功能研究和利用奠定基础。【方法】采用BLASTP和HMMsearch 2种策略进行搜索,鉴定亚洲棉、雷蒙德氏棉、海岛棉、陆地棉4种棉花全基因组范围内的NLP转录因子家族成员。对确认后的棉花NLP家族成员进一步展开生物信息学分析,利用在线软件Expasy对分子量、理论等电点等理化性质进行预测;使用MEGA 7软件构建系统进化树;通过网站MEME进行蛋白保守基序分析;运用在线软件GSDS 2.0分析基因结构;TBtools进行染色体定位绘制;McscanX进行棉花NLP家族复制基因分析;利用PlantCARE网站预测棉花NLP基因家族启动子元件;通过TBtools绘制不同组织及非生物胁迫下棉花NLP基因表达热图,分析组织表达特性和响应非生物胁迫的特征。通过RT-qPCR分析缺氮和复氮处理后棉花NLP基因的表达情况。【结果】从亚洲棉、雷蒙德氏棉、海岛棉、陆地棉蛋白数据库中分别筛选出11、11、21和22个NLP转录因子成员,家族蛋白序列长度为693—996个氨基酸,相对分子质量为76.92—110.02 kDa,理论等电点为5.13—7.77,亚细胞定位几乎均定位于细胞核中,NLP基因启动子区发现大量激素响应和逆境响应顺式作用元件。系统进化分析将棉花NLP蛋白分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组,基因复制分析发现片段复制是NLP基因在棉花中扩张的主要方式。Ka/Ks均小于1显示棉花中NLP基因进化主要经历纯化选择。表达分析结果也证实棉花GHNLPs响应氮饥饿和复氮过程。【结论】从亚洲棉、雷蒙德氏棉、海岛棉、陆地棉中分别鉴定获得11、11、21和22个NLP转录因子成员,它们之间具有较高的保守性,又有一定程度的差异。陆地棉GHNLPs在缺氮及复氮处理过程中表达量发生显著变化,可能在棉花响应硝酸盐过程中具有一定作用。

硝酸盐调控豆科植物与根瘤菌共生固氮的机制研究

氮是植物生长发育所需的大量营养元素之一。硝态氮不仅可以被植物直接吸收利用,还可以作为重要的信号分子调控植物对氮素的响应、吸收、代谢相关基因的表达,从而影响植物的生长和发育。豆科植物可以通过与根瘤菌共生互作来获得生长所需的氮,但共生固氮是一个耗费植物能量的过程。当土壤中存在高浓度的氮素时,氮作为信号分子会影响共生固氮基因的功能从而抑制共生固氮过程。目前的研究表明,硝酸盐通过局部和系统的调控方式抑制共生固氮过程;结瘤自主调控(Autoregulation of nodulation,AON)和NLPs(NIN-like proteins)转录因子在硝酸盐抑制豆科植物根瘤形成中有着重要的作用。本文结合最近的研究进展,重点讨论NLPs转录因子和AON途径在硝酸盐抑制共生固氮过程的作用。