稳定表达马NLRP3 HEK293T细胞系的构建及用于马NLRP3炎性小体的研究

为构建稳定表达马NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(eqNLRP3)的细胞系,并用于eqNLRP3炎性小体激活的研究,本研究采用同源重组的方法将经PCR扩增的eqNLRP3和GFP基因克隆至pLPCX中,构建重组表达质粒pLPCX-Flag-eqNLRP3-GFP,经PCR和测序鉴定正确后与pCGP、pVSV-G共转染HEK293T细胞,48 h后获得携带eqNLRP3的慢病毒。将该慢病毒感染HEK293T细胞,并采用嘌呤霉素筛选携带绿色荧光(GFP+)的单克隆细胞。采用western blot鉴定该细胞中eqNLRP3蛋白的表达、反应原性及细胞遗传稳定性。Western blot结果显示在146.1 ku处出现特异性条带,且传至1、4、7、10代的细胞均出现该条带,表明获得稳定表达eqNLRP3蛋白的HEK293T细胞系HEK293Teq NLRP3(2G1细胞)。采用NLRP3特异性激活剂尼日利亚菌素(Nig)处理2G1细胞1 h;将表达质粒pCDNA3.1-eqASC-HA转染2G1细胞,加入Nig处理1 h,采用激光共聚焦显微镜分别观察上述细胞中e NLRP3的聚化状态,及在2G1细胞中表达eqASC后能否形成ASC斑点(eqNLRP3-eqASC的复合物,即NLRP3炎性小体激活的典型特征)。结果显示,正常2G1细胞中呈绿色荧光的eqNLRP3弥散分布于细胞质中,加入Nig后弥散的eqNLRP3在细胞质中形成典型绿色荧光的点状聚集。转染表达eqASC质粒的2G1细胞中出现的红色荧光(eqASC)主要在细胞质中呈弥散性分布;转染表达eqASC的2G1细胞用Nig处理后形成2.5μm的中间呈绿色荧光四周呈红色荧光的典型ASC斑点。上述结果表明2G1细胞可以响应特异性激活剂并诱导eqNLRP3的聚化,招募ASC形成ASC斑点。将本实验室构建的iGLuc报告系统中的4种表达炎性小体蛋白质粒分别与EIV各蛋白对应质粒共转染HEK293T细胞,24 h后利用该报告系统检测各组细胞中的荧光素酶活性;采用western blot检测各共转染细胞中各EIV蛋白的表达对该系统中4种炎性小体蛋白表达的影响,通过上述两个试验筛选能够激活eqNLRP3炎性小体的EIV蛋白。iGLuc报告系统检测结果显示,仅表达EIV M2蛋白质粒的细胞上清中荧光素酶活性显著高于阳性对照组(P<0.05);western blot结果显示,EIV M2蛋白的表达对4种炎性小体蛋白的表达均无明显影响,表明EIV M2蛋白激活了eqNLRP3炎性小体。将表达EIV M2蛋白及表达eqASC的质粒共转染2G1细胞,24 h后经激光共聚焦显微镜观察以进一步验证上述结果。结果显示,该组细胞中带绿色荧光的eqNLRP3出现点状聚集,并招募细胞质中带红色荧光的eqASC形成了ASC斑点,与i GLuc报告系统筛选结果一致。上述结果表明,EIV感染对HEK293Teq NLRP3细胞系中的eqNLRP3产生了聚化效应,并招募ASC形成ASC斑点。本研究建立了稳定表达eqNLRP3蛋白的HEK293T细胞系,为马属动物病原感染激活NLRP3炎性小体的评价奠定了物质基础。

健脾益肠散对溃疡性结肠炎大鼠NLRP3信号通路IL-1β、IL-18表达的影响

目的探讨健脾益肠散对溃疡性结肠炎(UC)模型大鼠NLRP3信号通路白细胞介素(IL)-1β、IL-18表达的影响。方法从40只SD大鼠随机选取10只作为正常组,其余大鼠自由饮用5%硫酸葡聚糖溶液7 d制备UC大鼠模型,将成模大鼠随机分为模型组、柳氮磺吡啶组和健脾益肠散组,每组10只。健脾益肠散组和柳氮磺吡啶组予相应药液灌胃,正常组和模型组予等体积蒸馏水灌胃,连续14 d。观察大鼠一般状况,并进行疾病活动指数(DAI)评分,ELISA检测大鼠血清核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、胱天蛋白酶1(Caspase-l)含量,免疫组化染色、Western blot和RT-PCR检测结肠组织IL-1β、IL-18蛋白及mRNA表达。结果与正常组比较,模型组大鼠一般状况较差,DAI评分显著升高(P<0.01),血清NLRP3、ASC、Caspase-l含量显著增加(P<0.01),结肠组织IL-1β、IL-18蛋白和mRNA表达均显著升高(P<0.01);与模型组比较,健脾益肠散组和柳氮磺嘧啶组大鼠一般状况明显好转,DAI评分显著降低(P<0.01),血清NLRP3、ASC、Caspase-l含量明显减少(P<0.05,P<0.01),结肠组织IL-1β、IL-18蛋白和mRNA表达均明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论健脾益肠散可抑制NLRP3信号通路IL-1β、IL-18表达,改善结肠免疫炎症损伤,发挥治疗UC作用。

厄贝沙坦通过调节NLRP3表达在糖尿病肾病大鼠中的保护作用

目的 观察糖尿病肾病大鼠中NLRP3(NOD-like receptor protein 3)的表达,并在沉默NLRP3和以血管紧张素受体抑制剂(ARB)厄贝沙坦干预后观察NLRP3及炎症和纤维化因子的表达变化,探讨厄贝沙坦对糖尿病肾病大鼠的保护作用。方法 雄性SD大鼠随机分成5组:对照(Control)组、模型(Model)组、空载(Model+Blank)组、NLRP3沉默(Model+NLRP3 Sh)组、ARB(Model+ARB)组,分别在糖尿病肾病模型建立后8周、12周处死大鼠并收集肾脏组织。实时荧光定量PCR检测NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、核因子κB(NF-κB)P65和波形蛋白(Vimentin)的mRNA表达水平;Western blot检测NLRP3、P65、热休克蛋白47(heat shock protein 47,HSP47)和Vimentin的蛋白表达水平;免疫荧光法观察NLRP3、Caspase-1和Vimentin的表达;PAS、PASM和Masson染色观察肾脏病理改变。结果 与对照组比较,模型组及空载组NLRP3、Caspase-1、P65和Vimentin mRNA的表达升高(均P<0.05),NLRP3、Caspase-1、P65、HSP47和Vimentin的蛋白表达升高(均P<0.05)。与模型组及空载组相比,NLRP3沉默组及ARB组的上述指标表达均下调(均P<0.05),模型组与空载组以上指标之间差异无统计学意义。病理染色结果显示NLRP3沉默和厄贝沙坦干预可减轻糖尿病肾病大鼠肾脏损害,减轻肾小球肥大、肾小球硬化、系膜扩张、间质纤维化。结论 糖尿病肾病大鼠肾脏NLRP3信号通路被激活,且炎性和纤维化因子表达上调。厄贝沙坦可阻断NLRP3信号通路,减轻肾脏损害。天然免疫受体NLRP3可能成为治疗糖尿病肾病的新靶点。

茶多酚通过抑制NLRP3炎症小体改善脓毒症小鼠的急性肺损伤

目的探讨茶多酚(TP)对NLRP3炎症小体的调控作用机制以及其对脓毒症相关急性肺损伤的治疗效用。方法将60只C57BL/6小鼠随机平均分为假手术组(单纯开腹探查盲肠后即关腹)、盲肠结扎穿孔组(开腹暴露并游离盲肠后行盲肠结扎与穿孔操作后关腹)以及盲肠结扎穿孔+TP治疗组(盲肠结扎穿孔前1周予TP灌胃),每组20只。建模完成后绘制生存曲线评估各组小鼠对脓毒症打击的耐受情况。测定各组小鼠肺湿/干质量比值、肺组织髓过氧化物酶(MPO)水平,并对肺组织进行HE染色和急性肺损伤评分,评估肺损伤程度。ELISA法测定肺组织内IL-1β、TNF-α及IL-6表达水平;蛋白免疫印迹实验检测肺组织内NLRP3、caspase-1 p10及ASC蛋白表达水平;免疫组化染色测定肺组织内MPO、caspase-8及NLRP3蛋白表达,评估各组小鼠肺内炎症情况。检测肺组织内MDA及H2O2以评估氧化应激水平;免疫荧光共染NLRP3和NOX4蛋白以探讨二者表达及共定位。结果TP治疗组小鼠术后72 h死亡率、小鼠肺湿/干质量比值、肺组织MPO水平以及急性肺损伤评分均较盲肠结扎穿孔组小鼠显著下降(P<0.05);TP治疗组小鼠肺组织内IL-1β、TNF-α及IL-6、NLRP3、caspase-1 p10、ASC等蛋白表达水平亦较盲肠结扎穿孔组小鼠显著降低(P<0.05);氧化应激相关检测结果提示,TP治疗组小鼠肺组织内MDA及H2O2水平较盲肠结扎穿孔组小鼠显著减低(P<0.05);免疫荧光共染则提示TP治疗组小鼠NOX4蛋白与NLRP3蛋白在肺组织内的表达和共定位较盲肠结扎穿孔组小鼠减少。结论TP可通过抑制NLRP3炎症小体相关炎症改善盲肠结扎穿孔诱导的小鼠脓毒症肺损伤,且这一调控机制可能与其对肺组织内氧化应激相关蛋白NOX4的表达抑制相关。

苍术酮通过调节Nrf2-NLRP3通路减轻LPS诱导的小鼠急性肺损伤实验研究

目的研究苍术酮调节核因子NF-E2相关因子(Nrf2)-NLRP3通路对LPS诱导急性肺损伤(ALI)小鼠的保护作用。方法构建ALI小鼠模型,实验分为对照组、模型组、地塞米松组及苍术酮低、中、高剂量组。ELISA测定各组小鼠血清及肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)水平;通过测定肺组织湿/干质量比重(W/D),评估其水肿程度,检测肺组织抗髓过氧化物酶抗体(MPO)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)超氧化物歧化酶(SOD)及丙二酮(MDA)含量以评估其体内抗氧化损伤的作用;HE染色法检查肺损伤情况,并进行评分;RT-qPCR测定各组小鼠肺组织Nrf2、HO-1、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18mRNA水平。结果苍术酮对LPS诱导的小鼠ALI具有较好的保护作用,可降低小鼠血清及肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平和W/D比值、肺组织MPO、MDA及NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18mRNA水平,提高血清IL-10水平及肺组织GSH-Px、SOD及Nrf2、HO-1 mRNA水平,明显改善肺组织学病理表现,降低肺组织病理评分,且呈剂量依赖性(P<0.05)。结论苍术酮可通过调节炎症因子及氧化应激以缓解ALI小鼠肺损伤,其机制可能与调节Nrf2-NLRP3通路有关。

NLRP3炎症小体抑制剂MCC950通过抑制Th1/Th17和促进Tregs改善脓毒症小鼠器官损伤

目的:探讨核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体抑制剂MCC950对脓毒症小鼠T细胞分化及器官损伤的影响。方法:将18只C57BL/6雄性小鼠随机分为假手术组(sham组)、脓毒症模型组(CLP组)和MCC950治疗组(MCC950组),每组6只。其中CLP组和MCC950组通过盲肠结扎穿孔(CLP)的方法制备脓毒症模型。MCC950组腹腔注射溶于0.5 mL 0.9%氯化钠溶液的MCC950(50 mg/kg),sham组和CLP组腹腔注射等体积的0.9%氯化钠溶液。CLP术后24 h收集小鼠血清及器官标本。HE染色法观察脓毒症小鼠肺脏、肾脏组织病理损伤程度,并计算生存率;Western blot法检测脾脏NLRP3蛋白含量;ELISA法检测小鼠血清和肺组织的细胞因子水平(IL-1β、IL-18、IL-1α、IL-6、TNF-α);分离脾脏获得脾脏淋巴细胞,采用流式细胞术检测辅助性T细胞(Th)1、Th17、调节性T细胞(Tregs)比例。结果:与sham组相比,CLP组小鼠肺组织炎性细胞浸润、水肿和肺泡壁增厚,肾小管刷状缘和上皮细胞减少,肾小球萎缩,肾小管成弥漫性扩张,大量炎性细胞浸润,脾脏NLRP3的蛋白表达上调(P<0.05),血清IL-1β、IL-18、IL-1α、IL-6、TNF-α水平均升高(P<0.05),肺组织中IL-1α、IL-6、TNF-α水平均升高(P<0.05),脾脏CD4^(+)IFN-γ^(+)Th1、CD4^(+)IL-17^(+)Th17、CD4^(+)CD25^(+)Foxp3^(+)Tregs比例均升高(P<0.05),小鼠7 d生存率为30%(P<0.05)。与CLP组相比,MCC950组小鼠肺组织炎性细胞浸润减轻,水肿减退,肾小管扩张不明显,炎性细胞浸润亦有所减轻,脾脏NLRP3的蛋白表达下调(P<0.05),血清IL-1β、IL-18、IL-1α、IL-6、TNF-α水平均降低(P<0.05),肺组织中IL-1α、IL-6、TNF-α水平均降低(P<0.05),脾脏CD4^(+)IFN-γ^(+)Th1、CD4^(+)IL-17^(+)Th17比例减少,CD4^(+)CD25^(+)Foxp3^(+)Tregs比例明显增加(P<0.05),小鼠7 d生存率显著提升(P<0.05)。结论:MCC950阻断NLRP3可改善脓毒症小鼠的器官损伤,其作用可能依赖于抑制Th1/Th17反应和促进Tregs反应。

基于NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡探讨针康法对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠的影响

目的:观察针康法对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)新生大鼠神经元NLRP3炎症小体及细胞焦亡的影响,探讨其改善缺氧缺血性脑损伤后运动功能缺损的可能机制。方法:选择120只7 d龄大鼠分为正常对照组(A组)、模型对照组(B组)、头穴丛刺组(C组)、康复训练组(D组)和针康组(E组),再均分为24 d、7 d和14 d 3个时间点。结扎颈总动脉构建HIBD动物模型。C组针刺百会以及左右各旁开2 mm处,1次/d,每次留针2 h;D组进行转笼转棒训练,1次/d,10 min/次;E组在头穴丛刺的基础上进行转笼转棒训练。在各时间点,采用网屏实验评定运动功能缺损,TUNEL+Caspase-1免疫荧光双标法观察海马区神经细胞焦亡的情况,蛋白印迹法检测海马区NLRP3、Caspase-1和GSDMD-N端蛋白表达。结果:相较于A组,经缺氧缺血造模处理的4组在各时间点网屏实验评分和海马区神经细胞焦亡率均显著升高,NLRP3、Caspase-1和GSDMD-N端蛋白的表达显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05);相比较B组,各治疗组在各时间点网屏实验评分和海马区神经细胞焦亡率均显著减少,NLRP3、Caspase-1和GSDMD-N端蛋白的表达水平降低,其中E组的疗效最明显,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:针康法可改善HIBD新生大鼠的运动功能缺损,且疗效优于单纯针刺或康复疗法,其机制可能与抑制NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡有关。

NLRP3/Caspase-1/IL-1β炎症小体通路在小鼠主动脉夹层形成中的作用

目的探讨NLRP3/Caspase-1/IL-1β炎症小体通路在小鼠主动脉夹层形成中的作用及机制。方法50只3周龄雄性C57BL/6小鼠(体质量10~13 g)按随机抽样法分为对照组(n=10,无干预)、β-氨基丙腈(β-aminopropionitrile,BAPN)组[n=20,饮水中加入1 g/(kg·d)BAPN]、BAPN+MCC950组[n=20,饮水中加入1 g/(kg·d)BAPN、腹腔注射NLRP3抑制剂MCC95020 mg/(kg·d)]。记录各组小鼠饮水量、体质量、主动脉夹层发生率、夹层相关病死率。采用HE染色观察主动脉壁炎症浸润;弹力纤维(elastic Van Gieson,EVG)染色观察主动脉壁弹力纤维断裂。采用免疫荧光检测NLRP3、IL-1β、α-SMA、OPN的平均荧光强度。采用Western blot检测NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、α-SMA、OPN表达水平。结果对照组无主动脉夹层发生及死亡,BAPN组主动脉夹层发生率为80%,夹层相关病死率为35%,且主动脉血管壁弹力纤维断裂、明显炎症浸润。与对照组比较,BAPN组中NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β蛋白表达增加,收缩型蛋白α-SMA减少而合成型蛋白OPN增加(P<0.05)。而给予NLRP3特异性抑制剂MCC950后,主动脉夹层发生率下降(80%vs 35%,P=0.004),夹层相关病死率下降(35%vs 15%,P=0.144),血管壁弹力纤维断裂、炎症浸润减少;与BAPN组比较,BAPN+MCC950组NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β蛋白表达降低,收缩型蛋白α-SMA表达增加而合成型蛋白OPN表达降低(P<0.05)。结论小鼠主动脉夹层的发生与NLRP3/Caspase-1/IL-1β炎症小体通路活化有关,而NLRP3抑制剂MCC950能减少主动脉夹层发生,具有血管保护作用。

法舒地尔通过抑制NLRP3炎症小体激活抑制Aβ_(1-42)诱导的小胶质细胞炎症反应

目的:基于NLRP3炎症小体探讨法舒地尔减轻Aβ_(1-42)诱导的BV2小胶质细胞损伤的机制。方法:BV2细胞分为:正常对照组、Aβ刺激组、Aβ+法舒地尔联合干预组、Aβ+MCC950(NLRP3抑制剂)联合干预组。显微镜下观察细胞形态;CCK8测定细胞活性;Griess测定NO释放量;免疫荧光染色检测NLRP3、caspase 1和IL-18表达;Western blot检测NLRP3、ASC、caspase 1、IL-1β和IL-18表达。结果:与正常对照组比较,Aβ_(1-42)刺激组BV2细胞激活,呈阿米巴样形态,活性下降,NO释放量增加,NLRP3、ASC、caspase 1、IL-1β和IL-18表达增加。法舒地尔干预和MCC950干预均可改善Aβ_(1-42)诱导的BV2细胞损伤,使细胞形态趋于正常,细胞活性有所增加,NO释放量降低,同时下调NLRP3、ASC、caspase 1、IL-1β和IL-18表达,两组间差异无统计学意义。结论:法舒地尔可能通过抑制NLRP3炎症小体激活减轻Aβ_(1-42)诱导的BV2细胞损伤和炎症反应。

基于TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路探究白芍总苷对自身免疫性甲状腺炎大鼠炎症损伤的影响

目的探讨白芍总苷对自身免疫性甲状腺炎(AIT)大鼠炎症损伤及TLR4/NF-κB/NLRP3通路的影响。方法实验分为对照组(Control)、模型组(Model)、白芍总苷组(TGP)、TLR4抑制剂组(TLR4 inhibitor)和TGP+TLR4激动剂组(TGP+TLR4 agonist),每组各10只。除Control组外,其余各组大鼠采用皮下注射甲状腺球蛋白与弗氏佐剂诱导AIT大鼠模型。给药6周后,苏木精-伊红(HE)染色观察甲状腺组织病理学变化;酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清TPOAb、TgAb、TSH、T3、T4、TNF-α、INF-γ、IL-1β、IL-18水平;RT-qPCR和Western blot检测甲状腺组织TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路mRNA和蛋白表达。结果与Control组相比,Model组大鼠甲状腺滤泡上皮明显受损,TPOAb、TgAb、TSH、T3、T4、TNF-α、INF-γ、IL-1β、IL-18水平升高(P<0.01),TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路mRNA和蛋白表达升高(P<0.01)。与Model组相比,TGP组、TLR4 inhibitor组大鼠甲状腺滤泡上皮损伤减轻,TPOAb、TgAb、TSH、T3、T4、TNF-α、INF-γ、IL-1β、IL-18水平降低(P<0.01),TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路mRNA和蛋白表达降低(P<0.01)。与TGP组相比,TGP+TLR4 agonist组大鼠甲状腺滤泡上皮损伤加重,TPOAb、TgAb、TSH、T3、T4、TNF-α、INF-γ、IL-1β、IL-18水平升高(P<0.05或P<0.01),TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路mRNA和蛋白表达增加(P<0.05或P<0.01)。结论TGP通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路,改善甲状腺组织炎症损伤发挥甲状腺保护作用。

基于NLRP3介导的细胞焦亡探讨痹通方含药血清对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞损伤的保护作用及机制

目的探讨痹通方含药血清对脂多糖(LPS)诱导的类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(MH7A)的细胞焦亡的保护作用机制及对NLRP3通路的影响。方法SD大鼠随机分成3组:空白对照组,痹通方低、高剂量组分别给予4.2 g/(kg·d)、16.8 g/(kg·d)灌胃;空白对照组给予等量蒸馏水灌胃。连续灌胃10 d后制备含药血清。将细胞分为5组:空白对照组,LPS处理组,痹通方含药血清低、高剂量组,MCC950组。收集上述各组细胞,CCK8检测细胞活力,RT-qPCR检测各组细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-18、IL-1β、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、MIP-1α基因表达水平及Western blotting检测AIM2、ASC、Caspase-1、IL-18、IL-1β、cleaved-GSDMD、GSDMD、NLRP3蛋白表达。免疫荧光染色法检测NLRP3表达情况。结果与空白组比较,LPS处理组细胞活力下降(P<0.01),TNF-α、IL-18、IL-1β、MCP-1、MIP-1αmRNA表达升高(P<0.01),AIM2、ASC、Caspase-1、IL-18、IL-1β、cleaved-GSDMD、GSDMD、NLRP3蛋白表达升高(P<0.01);免疫荧光结果显示,与空白对照比较,模型组NLRP3荧光强度显著升高(P<0.01)。与LPS处理组相比,给予NLRP3抑制剂MCC950组和痹通方含药血清组均可改善上述指标变化。结论痹通方能有效抑制NLRP3炎症小体表达,减少MH7A细胞焦亡及改善炎症损伤,其机制可能与调控NLRP3通路相关。

柴黄清胰活血颗粒通过抑制NLRP3炎症小体活化减轻重症急性胰腺炎模型大鼠炎症损伤的机制研究

目的通过观察柴黄清胰活血颗粒对NLRP3炎症小体活化的调控作用,探讨其对重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)模型大鼠胰腺组织的作用及机制。方法将64只SD大鼠随机分为假手术组、重症急性胰腺炎模型组、柴黄清胰活血颗粒组及MCC950(NLRP3抑制剂)组,各组再分为12 h和24 h两个亚组,每组8只。重症急性胰腺炎模型组、柴黄清胰活血颗粒组及MCC950组给予3.5%的牛磺胆酸钠(2 mL·kg^(-1))逆行胰胆管注射构建重症急性胰腺炎模型。MCC950组于模型制备完成后立即腹腔注射MCC950(1 mg·mL-1)。麻醉苏醒后,柴黄清胰活血颗粒组灌胃柴黄清胰活血颗粒溶液(0.35 g·mL-1),6 h一次。造模后12 h和24 h收集腹水、腹主动脉血及胰腺组织。采用全自动生化分析仪检测血清淀粉酶及脂肪酶活性;HE染色观察胰腺损伤情况;ELISA法检测血清IL-18、IL-1β的变化,IHC、qRT-PCR及Western Blot法检测NLRP3炎症小体活化相关基因及蛋白的表达。结果与重症急性胰腺炎组比较,柴黄清胰活血颗粒组及MCC950组的胰腺组织病理损伤明显减轻,病理评分明显降低(P<0.05),血清脂肪酶、淀粉酶、白细胞介素(IL)-18、IL-1β水平明显降低(P<0.05);与重症急性胰腺炎组比较,经柴黄清胰活血颗粒治疗或腹腔注射NLRP3抑制剂后,胰腺组织NLRP3、ASC、Caspase-1免疫组化阳性表达量及NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA表达水平和NLRP3、ASC、Pro-Caspase-1、Caspase-1蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论柴黄清胰活血颗粒可通过抑制NLRP3炎症小体活化,降低胰腺组织NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA及蛋白的表达,降低下游炎症因子IL-18、IL-1β的释放,从而减轻重症急性胰腺炎模型大鼠胰腺炎症损伤。

基于NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡探讨痹通方对类风湿关节炎大鼠的保护作用及机制

目的探讨痹通方通过调控NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)炎症小体介导的细胞焦亡途径对类风湿关节炎大鼠的保护作用及机制。方法将70只SD大鼠随机分为7组:痹通方低、中、高剂量组分别给予4.2、8.4、16.8 g/(kg·d)灌胃,甲氨蝶呤组按7.5 mg/(kg·d)灌胃,MCC950组30 mg/(kg·d)灌胃,正常组和模型组给予蒸馏水灌胃。于造模后第29天开始灌胃给药,1次/d。在末次给药8 h后取材,HE染色法检测各组大鼠踝关节组织形态学变化;ELISA法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-18(IL-18)、白介素-1β(IL-1β)相关指标变化;RT-qPCR法检测TNF-α、IL-18、IL-1β、血清单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、巨噬细胞炎性蛋白-1a(MIP-1a)相关基因水平变化,免疫组化法检测IL-1β,NLRP3蛋白水平变化,Western Blot法检测黑素瘤缺乏因子2(AIM2)、凋亡相关点样蛋白(ASC)、半胱氨酸蛋白酶前体-1(pro-Caspase-1)、Caspase-1、IL-18、IL-1β、活化的gasdermin D(cleaved-GSDMD)、GSDMD、NLRP3。结果与正常组比较,模型组大鼠踝关节间隙变窄,关节软骨表面不规则增厚,骨质出现轻度破坏,关节内可见炎性细胞和滑膜组织增生(P<0.01),模型组血清TNF-α、IL-18、IL-1β含量均明显升高(P<0.01),模型组TNF-α、IL-18、IL-1β、MCP-1、MIP-1a mRNA表达均明显升高(P<0.01),免疫组化法显示模型组IL-1β、NLRP3蛋白表达水平均明显升高(P<0.01),WB法显示模型组AIM2、ASC、pro-Caspase-1、Caspase-1、IL-18、IL-1β蛋白表达水平均明显升高(P<0.01)。与模型组比较,痹通方高剂量组、甲氨蝶呤组及MCC950组上述各项检测指标均得到明显改善(P<0.05或0.01)。结论痹通方能够改善大鼠类风湿关节炎状态,其机制可能与调控NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡途径相关。

清热祛浊胶囊对非酒精性脂肪肝炎小鼠NF-κB/NLRP3信号通路的调控机制研究

[目的]研究清热祛浊胶囊(QRQZ)对非酒精性脂肪肝炎(NASH)模型小鼠的治疗效果及对核转录因子-κB(NF-κB)/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)信号通路的影响。[方法]通过蛋氨酸和胆碱缺乏(MCD)饮食诱导建立NASH小鼠模型,并灌胃不同剂量的QRQZ。通过检测各组小鼠体质量、肝指数、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC),肝苏木素-伊红(HE)染色及油红O染色评估QRQZ对NASH模型小鼠的治疗作用;通过检测超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)水平评估QRQZ对NASH模型小鼠氧化应激水平;通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测白细胞介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平评估QRQZ对NASH模型小鼠炎症的影响;通过检测磷酸化核因子κB抑制蛋白(p-IκB)、磷酸化核转录因子κB P65(p-NF-κB P65)、NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(cleaved Caspase-1)、mature IL-1β的蛋白水平以及NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β的mRNA表达来评估QRQZ对NASH小鼠NF-κB/NLRP3信号通路的影响。[结果] QRQZ可改善MCD引起的体质量减轻,降低肝指数,降低血清ALT、AST活性及TC、TG水平,同时改善肝组织病理学变化,提示QRQZ对NASH模型小鼠具有治疗作用;此外,QRQZ提升肝组织中SOD、GSH-Px活性,降低了MDA水平,降低了IL-6、IL-1β、iuTNF-α炎症因子水平,提示了QRQZ的抗氧化及抗炎作用;进一步研究发现QRQZ降低了IκB与P65的磷酸化水平,减少NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β蛋白及基因表达。提示QRQZ干预抑制了NASH小鼠NF-κB/NLRP3信号通路活化。[结论] QRQZ对NASH模型小鼠具有治疗作用,并且可以提升抗氧化能力改善炎症,其作用机制可能与抑制NF-κB/NLRP3信号通路活化有关。

电针对慢性前列腺炎大鼠TLR4/NF-κB/NLRP3通路蛋白表达的影响

目的观察电针对慢性前列腺炎大鼠前列腺Toll样受体4/核转录因子κB/NOD样受体蛋白3(TLR4/NF-κB/NLRP3)通路的影响,探讨电针治疗慢性前列腺炎的可能机制。方法将40只SPF级健康雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组、电针组、抑制剂组、激动剂组,各8只。除空白组外,其余各组采用前列腺蛋白提取及免疫注射法制备大鼠慢性前列腺模型,于造模后1 d对电针组、抑制剂组及激动剂组大鼠行电针干预,穴取“白环俞”“会阳”,连续波,频率2 Hz,每日1次,每次20 min,7 d为1个疗程,每疗程后休息1 d,共治疗2个疗程。基于开野实验和糖水消耗实验开展行为学测试;取大鼠前列腺组织,计算前列腺湿重及前列腺指数;HE染色观察大鼠前列腺组织形态学变化;TUNEL法观察前列腺细胞凋亡;Western blot法检测前列腺组织中TLR4、NF-κB、NLRP3蛋白表达。结果与空白组比较,模型组大鼠水平运动评分、垂直运动评分和糖水消耗量均显著下降(P<0.05);与模型组比较,电针组大鼠水平运动评分、垂直运动评分和糖水消耗量显著增加(P<0.05);与电针组比较,抑制剂组大鼠水平运动评分、垂直运动评分和糖水消耗量显著增加,而激动剂组大鼠水平运动评分、垂直运动评分和糖水消耗量显著下降(P<0.05)。与空白组比较,模型组大鼠前列腺湿重和前列腺指数显著升高(P<0.05),前列腺细胞凋亡升高(P<0.05);与模型组比较,电针组大鼠前列腺湿重和前列腺指数显著下降(P<0.05),前列腺细胞凋亡显著下降(P<0.05);与电针组比较,抑制剂组大鼠前列腺湿重和前列腺指数显著下降(P<0.05),而激动剂组大鼠前列腺湿重和前列腺指数显著升高(P<0.05),且抑制剂组大鼠前列腺细胞凋亡进一步下降(P<0.05),而激动剂组大鼠前列腺细胞凋亡升高(P<0.05)。与空白组比较,模型组大鼠前列腺组织中TLR4、p-NF-κB/NF-κB、NLRP3蛋白表达显著增加(P<0.05),与模型组比较,电针组大鼠前列腺组织中TLR4、p-NF-κB/NF-κB、NLRP3蛋白表达显著减少(P<0.05);与电针组比较,抑制剂组大鼠前列腺组织中TLR4、p-NF-κB/NF-κB、NLRP3蛋白表达显著下降(P<0.05),而激动剂组大鼠前列腺组织中TLR4、p-NF-κB/NF-κB、NLRP3蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论电针白环俞、会阳可明显改善慢性前列腺模型大鼠症状,降低细胞凋亡水平,其机制可能与下调TLR4/NF-κB/NLRP3通路蛋白表达,进而抑制前列腺细胞凋亡有关。

盐酸小檗碱抑制NLRP3介导的细胞焦亡改善DSS诱导的大鼠溃疡性结肠炎

目的:盐酸小檗碱(BBR)是治疗溃疡性结肠炎(UC)的常用药,但其挽救炎症反应导致的细胞焦亡的分子机制有待进一步研究。方法:SD雄性大鼠随机分为4组:对照组(Ctrl)、DSS模型组、BBR治疗组(DSS+BBR)、BBR+NLRP3激动剂组(DSS+BBR+BMS-986299)。采用右旋葡聚糖硫酸钠法(DSS)构建UC大鼠模型,同时BBR治疗组和BBR+NLRP3激动剂组每日灌胃BBR 2次,连续7 d,BBR+NLRP3组每日2次腹腔注射BMS-986299。实验期间每天称量体质量、观察小鼠一般情况并评估疾病活动指数(DAI);实验结束后解剖观察并评估结肠大体形态、测量长度;组织切片HE染色,光镜下观察结肠组织的病理学变化并评估组织损伤指数(TDI);ELISA检测结肠组织中细胞因子TNF-α和IL-1β含量,Western blot检测NLRP3、ASC、GSD?MD-N、Cleaved-caspase 1和IL-1β的表达。结果:BBR能够有效改善UC引起的体质量减轻、结肠的组织完整性、细胞焦亡,并降低结肠中TNF-ɑ、IL-1β等炎症因子的表达、焦亡细胞的比例以及NLRP3、IL-1β、GSDMD-N、Cleaved-caspase 1等细胞焦亡通路中关键蛋白的表达,并且BBR的治疗效果和调节表达的蛋白因NLRP3激活而逆转。结论:BBR通过降低细胞焦亡通路中NLRP3、IL-1β、GSDMD-N、Cleaved-caspase 1等蛋白的成熟体表达,发挥治疗效果,为BBR治疗UC提供了分子依据。

骆驼蓬对类风湿关节炎NLRP3、TLR4信号通路的影响

目的探究骆驼蓬外敷对类风湿关节炎大鼠NLRP3、TLR4信号通路及滑膜损伤的影响。方法24只SD雌雄各半大鼠随机分组(对照组、模型组和骆驼蓬组,n=8)。对模型组和骆驼蓬组进行胶原诱导型关节炎(CIA)构建大鼠类风湿关节炎模型(14 d免疫造模)。造模完成对骆驼蓬组大鼠进行骆驼蓬外敷[0.50 g/(kg·d)],持续治疗28 d,对照组、模型组不作处理。治疗期间定期对大鼠的关节肿胀度、关节炎指数进行追踪记录。大鼠给药28 d后处死,ELISA检测其血清及滑膜组织上清液中类风湿因子(RF)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-18(IL-18)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)对滑膜组织中的NLRP3信号通路分子(caspase-1、IL-1β、IL-18)和TLR4信号通路分子[Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)、磷酸化核因子kB p65(p-NF-kB p65)、核蛋白(NF-kB p65)]及其mRNA表达水平进行检测。结果根据检测结果可知,模型组大鼠右后肢关节肿胀度(4.67±0.53)mm远大于骆驼蓬组关节肿胀度(2.78±0.38mm);模型组和骆驼蓬组关节炎指数随着试验的推进不断增加,骆驼蓬组始终低于模型组;ELISA检测发现模型组体内的RF、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平均比对照组和骆驼蓬组显著增高(P<0.001);Western blot检测发现:模型组NLRP3信号通路分子(caspase-1、IL-1β、IL-18、IL-1βmRNA、IL-18mRNA)表达水平和TLR4信号通路分子(TLR4、MyD88、p-NF-kB p65及TLR4 mRNA)表达水平均比对照组和骆驼蓬组显著增高(P<0.001)。结论骆驼蓬外敷可以通过降低血清细胞因子水平,抑制NLRP3、TLR4信号通路,影响其蛋白及mRNA表达,缓解类风湿关节炎,降低对关节滑膜的损伤。

麝香酮对胰腺癌中NLRP3炎症体通路介导的上皮间质转化的影响

目的探讨麝香酮(MUS)对胰腺癌(PC)的抗癌作用及其对核苷酸结合寡化结构域样受体3(NLRP3)炎症体通路和上皮间质转化(EMT)的影响。方法根据MUS处理浓度不同将人胰腺癌细胞(PANC1)细胞分为0μM组、0.1μM组、0.5μM组、1μM组、2μM组和4μM组,各组细胞使用相应浓度的MUS孵育48 h。使用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定生长抑制率和半抑制浓度(IC50)值,使用Annexin V-FITC/PI染色法测定细胞凋亡,使用Transwell测定细胞迁移和侵袭。使用Western blot测定Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤(Bcl-2)、基质金属蛋白酶(MMP2)、MMP9、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、NLRP3、半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)和血清人细胞凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的蛋白表达水平。通过对BALB/c雄性裸鼠皮下注射PANC1细胞构建移植瘤模型,然后将裸鼠随机分为对照组和MUS组,每组6只。对照组裸鼠给予腹腔注射100μL的1%二甲基亚砜(DMSO),MUS组裸鼠给予腹腔注射100μL的MUS溶液(20 mg/kg)。给药21 d后测量裸鼠肿瘤体积和重量。结果与0μM组相比,0.1μM组、0.5μM组、1μM组、2μM组和4μM组的PANC1细胞的生长抑制率逐渐升高,凋亡率逐渐升高(均P<0.05),Bax蛋白表达水平逐渐升高,Bcl-2蛋白表达水平逐渐降低(P<0.05)。与0μM组相比,0.1μM组、0.5μM组、1μM组、2μM组和4μM组的迁移和侵袭细胞数逐渐降低(P<0.05),MMP2和MMP9蛋白表达水平逐渐降低(P<0.05)。与0μM组相比,0.1μM组、0.5μM组、1μM组、2μM组和4μM组的E-cadherin蛋白表达水平逐渐升高,N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平逐渐降低(P<0.05),NLRP3、caspase-1和ASC蛋白表达水平逐渐降低(P<0.05)。与对照组比较,MUS组裸鼠的肿瘤体积和重量均降低(P<0.05),肿瘤组织中的NLRP3、caspase-1和ASC蛋白表达水平均降低(P<0.05)。结论MUS具有良好的抗PC作用,可能通过抑制NLRP3炎症体通路介导的EMT发挥抗癌作用。

无患子皂苷对自发性高血压大鼠血管内皮功能和NLRP3炎性小体的影响

目的探讨无患子皂苷对自发性高血压大鼠血管内皮功能和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体的影响。方法将6只WKY大鼠设为对照组,18只自发性高血压大鼠(SHR)分为模型组、无患子皂苷组和替米沙坦组,每组6只。对照组和模型组大鼠灌胃生理盐水,无患子皂苷组和替米沙坦组分别灌胃无患子皂苷(162 mg/kg)和替米沙坦(10 mg/kg),连续灌胃35 d。给药结束后测量各组大鼠尾动脉收缩压(SBP)和舒张压(DBP),免疫组化法检测胸主动脉内膜中血管性假血友病因子(vWF)表达,HE染色观察大鼠胸主动脉组织病理变化,ELISA法检测血清中半胱天冬氨酸蛋白酶1(caspase-1)和白细胞介素1β(IL-1β)水平,RT-qPCR和Western blot法检测主动脉组织中p38、NLRP3、caspase-1 mRNA和蛋白表达。结果与对照组比较,模型组大鼠尾动脉SBP和DBP、血清中caspase-1和IL-1β水平、胸主动脉中p38、NLRP3、caspase-1 mRNA和蛋白表达均升高(P<0.01),胸主动脉内膜中vWF阳性表达增多(P<0.01),主动脉内膜和外膜脱落严重,中膜增厚;与模型组比较,无患子皂苷组和替米沙坦组大鼠尾动脉SBP和DBP、血清中caspase-1和IL-1β水平、胸主动脉中p38、NLRP3、caspase-1 mRNA和蛋白表达均降低(P<0.05),胸主动脉内膜中vWF阳性表达减少(P<0.05),主动脉内外膜损伤减轻,中膜厚度也有所降低。结论无患子皂苷能够有效降低自发性高血压大鼠的血压,改善血管内皮功能障碍,抑制炎症反应,其机制可能与抑制NLRP3炎症通路的激活有关。

健脾益肠散对TNF-α诱导的树突状细胞NLRP3炎症小体信号通路表达的影响

目的观察健脾益肠散对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的树突状细胞(DCs)NLRP3炎症小体信号通路相关蛋白表达的影响,探讨其治疗溃疡性结肠炎的作用机制。方法分离培养C57BL/6小鼠原代DCs,分为正常组、模型组、阴性对照组、阳性药组和中药组,TNF-α诱导构建DCs炎症微环境模型,各组分别予相应处理后,采用CCK-8法检测细胞增殖能力,免疫荧光、Western blot分别检测DCs核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、胱天蛋白酶-1(Caspase-1)蛋白表达,Western blot、RT-PCR分别检测DCs白细胞介素(IL)-1β、IL-18蛋白和mRNA表达。结果与正常组比较,模型组DCs增殖能力显著下降(P<0.01),细胞NLRP3、ASC、Caspase-1阳性表达显著升高,NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-18、IL-1β蛋白表达及IL-18、IL-1βmRNA表达显著升高(P<0.01);与模型组和阴性对照组比较,阳性药组和中药组DCs增殖能力显著上升(P<0.01),细胞NLRP3、ASC、Caspase-1阳性表达显著降低(P<0.01),NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表达显著降低(P<0.05,P<0.01),IL-1β、IL-18mRNA表达显著降低(P<0.01),且中药组细胞增殖能力、Caspase-1阳性表达、IL-18 mRNA表达均明显高于阳性药组(P<0.05),IL-1βmRNA表达明显低于阳性药组(P<0.05)。结论健脾益肠散能抑制TNF-α诱导的DCs炎性反应,其治疗溃疡性结肠炎作用机制可能与调控NLRP3炎症小体信号通路NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-18、IL-1β表达有关。