基于NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路探讨针灸预防应激性胃溃疡细胞焦亡的作用机制

目的:观察针刺与艾灸对应激性胃溃疡模型大鼠的防治作用及其对模型大鼠胃黏膜NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)/消皮素D(GSDMD)细胞焦亡通路的干预作用,探索其作用机制。方法:将SD大鼠随机分为正常组、模型组、预灸组和预针刺组。预灸组和预针刺组大鼠分别予艾灸、针刺中脘、足三里,每穴刺激20 min,连续7 d;正常组、模型组大鼠仅予艾灸支架固定。除正常组外,其余各组大鼠采用无水乙醇与阿司匹林混悬液灌胃制备应激性胃溃疡模型。造模结束后次日,各组大鼠麻醉后取血分离血清,取胃黏膜组织。评估胃黏膜损伤指数(UI),苏木精-伊红(HE)染色法观察胃黏膜组织的病理形态变化,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-18水平,蛋白质免疫印迹(Western blot)法分析胃黏膜组织NLRP3、Caspase-1及GSDMD蛋白表达。结果:模型组大鼠UI值明显高于正常组(P<0.01),胃黏膜组织明显损伤,存在出血灶,病理显示大量红细胞渗出;预灸组和预针刺组大鼠UI值均明显低于模型组(P<0.01),其中预灸组UI值明显低于预针刺组(P<0.05);预灸组和预针刺组胃黏膜组织表面只有少量出血灶,病理显示胃黏膜大体完整,有少量红细胞渗出,其中预灸组胃黏膜病变程度更轻。模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18水平均明显高于正常组(P<0.01);预灸组和预针刺组上述指标水平均明显低于模型组(P<0.05,P<0.01),其中预灸组上述指标水平均明显低于预针刺组(P<0.05,P<0.01)。模型组大鼠胃黏膜组织NLRP3、Caspase-1及GSDMD蛋白表达水平均显著高于正常组(P<0.05);预灸组和预针刺组上述蛋白表达水平均明显低于模型组(P<0.05),其中预灸组Caspase-1蛋白表达水平明显低于预针刺组(P<0.05)。结论:针刺与艾灸均可以预防应激性胃溃疡胃黏膜损伤,其可能通过调控胃黏膜组织中NLRP3/Caspase-1/GSDMD细胞焦亡通路蛋白表达水平,缓解胃黏膜炎症反应,其中艾灸预处理对炎症因子的改善更具优势。

基于NLRP3/caspase-1/GSDMD信号通路介导的细胞焦亡探讨大黄糖络丸对糖尿病肾脏疾病的干预效应

目的探讨大黄糖络丸(Dahuang Tangluo pills,DHTL)对糖尿病肾脏疾病(diabetic kidney disease,DKD)db/db小鼠NOD样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1(cystein-asparate protease-1,caspase-1)/消皮素D(gasdermin D,GSDMD)通路介导的细胞焦亡的干预效应及机制。方法将8只db/m小鼠作为空白对照组,将40只db/db小鼠造模成功后随机分为模型组,DHTL低剂量组、中剂量组、高剂量组,达格列净组,每组各8只。空白组和模型组给予等体积生理盐水灌胃,DHTL低、中、高剂量组分别给予DHTL溶液0.9、1.8、3.6 g·kg^(-1),达格列净组给予达格列净片溶液1.5 mg·kg^(-1),6组小鼠均每日灌胃1次,连续给药10周,给药期间每日检测小鼠体质量并调整灌胃剂量。给药结束后分别检测各组小鼠空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)及体质量;采用全自动生化分析仪检测小鼠24 h尿总蛋白(24 h urine protein,24h-UTP)、血肌酐(creatinine,Scr)及尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)水平;采用ELISA测定小鼠肾组织中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平;HE染色观察小鼠肾组织病理改变;TUNEL染色观察小鼠肾组织细胞DNA的损伤情况;采用RT-PCR和Western blot检测小鼠肾组织NLRP3、caspase-1、GSDMD mRNA及蛋白表达。结果与空白组比较,模型组小鼠FBG、体质量、24h-UTP、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α均明显升高(P<0.01);小鼠肾脏组织中NLRP3、caspase-1、GSDMD mRNA及蛋白表达明显增加(P<0.01)。与模型组比较,各给药组小鼠FBG、体质量、24h-UTP、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平不同程度降低(P<0.05);小鼠肾脏组织病理形态均不同程度改善,肾脏组织阳性细胞数量明显减少(P<0.05);DHTL高、中剂量组及达格列净组小鼠肾组织NLRP3、caspase-1、GSDMD mRNA及蛋白表达均明显下降(P<0.05)。结论DHTL可改善DKD小鼠的肾损伤,其机制可能通过调控NLRP3/caspase-1/GSDMD通路抑制细胞焦亡,缓解DKD小鼠的炎症反应。

NLRP3/Caspase-1/GSDMD细胞焦亡信号轴在六味地黄丸防治大鼠骨质疏松症中的作用

目的基于NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号轴探讨六味地黄丸抗骨质疏松的作用。方法48只健康SD大鼠,随机分为假手术组、模型组、六味地黄丸组以及阿仑膦酸钠组,每组12只。除假手术组外,其余各组经双侧卵巢切除造模后,六味地黄丸组予以六味地黄丸157.5 mg/(kg·d)灌胃,阿仑膦酸钠组予以阿仑膦酸钠片7.35 mg/(kg·d)灌胃,假手术组与模型组给予等量生理盐水灌胃,干预12周后取得大鼠骨组织以备分析。采用骨组织转录组学(RNA-Sequence)对模型组和六味地黄丸组进行测序分析;分析大鼠骨矿含量、弹性模量、股骨刚度、右侧股骨和腰椎骨密度(bone mineral density,BMD)水平变化;采用酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清半胱氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)等水平;采用实时荧光定量PCR法(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)检测骨组织中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)、Caspase-1、GSDMD(gasdermin-D)mRNA表达水平;采用Western blot法检测骨组织NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达水平。结果RNA-Sequence测序分析与KEGG分析表明,六味地黄丸组富集潜在靶基因最多的通路有细胞焦亡通路和炎症通路;热图差异表达基因排在前6位的为:NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-6、IL-1β、TNF-α。与模型组比较,六味地黄丸组大鼠骨矿含量和弹性模量升高(P<0.05),股骨刚度、右侧股骨和腰椎BMD均明显升高(P<0.01);六味地黄丸组大鼠血清Caspase-1、IL-1β、TNF-α含量较模型组均明显降低(P<0.01);六味地黄丸组NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA表达量较模型组均降低(P<0.05),NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路相关蛋白表达量亦降低(P<0.05)。结论六味地黄丸能够通过抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号轴降低炎症水平,以抗骨质疏松。

利多卡因通过NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路介导的细胞焦亡抑制乳腺癌细胞增殖

目的研究利多卡因能否通过调控NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路介导的细胞焦亡抑制乳腺癌细胞增殖。方法将乳腺癌MCF-7细胞随机分为空白对照组(NC组),利多卡因组低、中、高剂量组(LIDO-L、M、H组)和LIDO-H+MCC950组,CCK-8法检测细胞增殖能力;Transwell小室法检测细胞侵袭能力;流式细胞仪和免疫荧光染色检测细胞焦亡;蛋白质印迹和qRT-PCR法检测细胞中NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白和mRNA表达。结果和NC组相比,LIDO-L组、LIDO-M组、LIDO-H组MCF-7细胞存活率、细胞侵袭数目均明显降低,细胞焦亡率、细胞中GSDMD阳性细胞数、细胞中NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达及m RNA表达均明显增加(P<0.05)。和LIDO-H组相比,LIDO-H+MCC950组细胞存活率和侵袭细胞数目明显增加,细胞焦亡率和GSMDM阳性细胞数明显减少,细胞中NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白和mRNA表达明显降低(P<0.05)。结论利多卡因可抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖和侵袭,其可能与激活NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路促进细胞焦亡有关。

艾灸预处理对急性胃黏膜损伤大鼠NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路的影响

目的:观察艾灸预处理对急性胃黏膜损伤大鼠胃黏膜细胞焦亡NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路的影响。方法:将30只健康SPF级SD大鼠雌雄各半,分为正常组、模型组和艾灸预处理组。选取足三里(双侧)和中脘穴进行艾灸预处理7 d,再用无水乙醇灌胃法进行造模,观察胃黏膜组织形态,评估UI指数,ELISA法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)和白介素18(IL-18)3种细胞因子的表达量;Western blot检测大鼠胃组织炎性小体核苷酸寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)及胱天蛋白酶-1(Caspase-1)、消皮素(GSDMD)的表达水平。结果:艾灸预处理后,机体在应对致病因素刺激时可抑制IL-1β、IL-18及TNF-α的分泌,对比正常组和模型组均有明显下降(P<0.01),NLRP3、Caspase-1和GSDMD蛋白的表达量均低于正常组和模型组(P<0.01)。结论:艾灸预处理通过NLRP3/Caspase-1/GSDMD经典通路途径抑制细胞焦亡,降低炎症发生的程度,达到保护胃黏膜的作用。

从NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路探讨健心颗粒对糖尿病心肌病大鼠心肌焦亡的影响

目的从NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路探讨健心颗粒对糖尿病心肌病大鼠心肌焦亡的影响,明确其作用机制。方法将40只6周龄SPF级SD大鼠按随机数字表法分成空白组、模型组、西药组、中药组及西药+中药组,每组8只。空白组不予造模,其余各组采用高糖高脂喂养+腹腔注射链脲佐菌素的方法制备糖尿病心肌病模型。造模成功后空白组、模型组均给予生理盐水5 mL,西药组给予卡托普利5 mg/kg,中药组给予健心颗粒3.2 g/kg,西药+中药组予健心颗粒3.2 g/kg+卡托普利5 mg/kg,早晚各灌胃1次,共8周。心脏彩超比较5组大鼠心脏室间隔厚度(IVST)、左心室射血分数(LVEF)、左室舒张末径(LVEDD)、左室收缩末径(LVESD)情况;TUNEL法检测5组大鼠心肌细胞焦亡情况;qPCR及Western blot分别检测5组大鼠心肌组织NOD样受体热蛋白结构域3(NLRP3)、半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、消皮素D(GSDMD)mRNA表达水平及蛋白表达量;ELISA法检测5组大鼠血清白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)含量。结果与空白组比较,模型组IVST、LVEF降低,LVEDD、LVESD升高,心肌细胞焦亡增多,NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA表达水平及蛋白表达量均上升,血清中的IL-1β、IL-18含量显著增多(P<0.05);与模型组比较,各给药组IVST、LVEF明显升高,LVEDD、LVESD降低,心肌细胞焦亡减少,NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA表达水平及蛋白表达量均下降,血清中的IL-1β、IL-18含量减少(P<0.05);其中,西药+中药组上述指标改善最显著,而中药组与西药组组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论健心颗粒可能通过调控NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路,抑制DCM大鼠心肌细胞焦亡。

延胡索总生物碱对慢性癫痫大鼠皮层NLRP3/caspase-1/GSDMD介导的细胞焦亡的影响

目的:研究延胡索总生物碱(TAC)对戊四氮(PTZ)所诱导的慢性癫痫大鼠的治疗作用,探讨其对大脑皮层核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)/caspase-1/消皮素D(GSDMD)介导的细胞焦亡的影响及可能机制。方法:清洁级雄性SD大鼠30只,随机抽取6只大鼠作为正常组,其余大鼠采用PTZ(35 mg/kg)腹腔连续注射28 d复制慢性癫痫模型。将造模成功的18只大鼠随机分为模型组、低剂量TAC组和高剂量TAC组,每组6只。低、高剂量TAC组大鼠分别灌胃给予7和14 mg/kg的TAC,连续给药14 d,正常组和模型组大鼠灌胃给予等体积生理盐水。观察记录大鼠全面强直阵挛发作(GTCS)和极小阵挛发作(MCS)的潜伏期;采用HE染色观察颞叶皮层的病理学变化;TUNEL法检测神经细胞凋亡;免疫组化和Western blot法检测皮层组织核因子κB(NF-κB)、NLRP3、caspase-1和GSDMD蛋白表达;免疫组化检测脑组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素18(IL-18)和IL-1β蛋白表达;RT-qPCR检测各组NLRP3、caspase-1和GSDMD的mRNA表达。结果:与正常组相比较,模型组大鼠GTCS和MCS的潜伏期显著缩短(P<0.01);模型组大鼠皮层神经细胞凋亡数量显著增加,皮层组织中TNF-α、IL-18和IL-1β蛋白表达均显著增加,NF-κB、NLRP3、caspase-1 p20和GSDMD N端片段(GSDMD-N)的mRNA及蛋白表达也显著增加(P<0.05或P<0.01);与模型组相比,各剂量TAC组大鼠GTCS和MCS的潜伏期显著延长,皮层神经细胞凋亡数量显著减少,皮层组织中TNF-α、IL-18和IL-1β蛋白表达均显著减少,NF-κB、NLRP3、caspase-1 p20和GSDMD的mRNA及蛋白表达也均显著减少(P<0.01)。结论:TAC可能通过NLRP3/caspase-1/GSDMD信号通路,减少炎症因子分泌,抑制神经细胞焦亡,从而对PTZ诱导的慢性癫痫大鼠起到治疗作用。

1,25-二羟维生素D3通过NLRP3/caspase-1/GSDMD信号轴干预中性粒细胞性哮喘

目的探讨1,25-二羟维生素D3对中性粒细胞性哮喘小鼠模型的气道炎症的干预作用,以及对NLRP3/caspase-1/GSDMD信号轴的影响。方法选取24只♀SPF级BALB/c小鼠,随机(随机数字表法)分为3组:正常对照组(A)、模型组(B)、治疗组(C),每组8只。用鸡卵清蛋白(OVA)结合脂多糖诱导的方法制作小鼠中性粒细胞性哮喘动物模型。C组在每次卵蛋白激发前给予0.1%的1,25-二羟维生素D腹腔注射(4μg·kg^(-1))。进行无创气道反应性检测,收集肺组织标本和支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF);病理HE染色、AB-PAS染色观察肺组织病理改变和气道黏液分泌情况;BALF中炎症细胞计数及分类,检测BALF中IL-1β、IL-18、IL-17水平;Ly-6G免疫组化染色了解肺组织中性粒细胞浸润;Western blot测定肺组织NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白表达水平。结果治疗组BALF中IL-1β、IL-18、IL-17分泌较模型组减少(P<0.05),中性粒细胞比例低于模型组,肺组织病理提示气道炎症病变较模型组减轻,AHR明显降低;肺组织NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白表达水平较模型组明显降低(P<0.05)。结论1,25-二羟维生素D3能减轻中性粒细胞性哮喘小鼠气道炎症和炎性细胞因子分泌,抑制NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白表达。1,25-二羟维生素D3可能通过调节NLRP3/caspase-1/GSDMD信号轴改善中性粒细胞性哮喘。

艾司洛尔通过阻断NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路抑制早期脓毒症大鼠心脏炎症反应及焦亡

目的研究艾司洛尔(Esmolol,ES)是否可通过抑制焦亡的经典通路进而发挥心脏保护作用。方法 72只大鼠随机分为假手术(sham operation,Sham)组、盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)组和ES组,每组24只。每组随机抽取8只大鼠观察生存情况,剩余16只大鼠根据处理时间分为6 h和24 h两个亚组,每组8只。Sham组仅给予开腹,翻动盲肠处理;CLP组和ES组采用CLP法建立脓毒症大鼠模型。Sham组、CLP组持续经大鼠左颈内静脉泵入生理盐水6 h;ES组持续泵入艾司洛尔稀释液6 h。分别于相应时间点处死大鼠,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清IL-1β、IL-18水平,采用免疫印迹法(Western blot)检测心肌组织NLRP3、Caspase-1及GSDMD蛋白表达水平;光学显微镜下观察心肌病理改变;荧光显微镜下观察心肌细胞焦亡情况。结果 (1)ELISA结果显示,与各时间点的Sham组比较,ES组大鼠血清IL-1β及IL-18水平均明显升高,24 h组最高;而与CLP组比较,上述因子水平在6 h与24 h均明显下降(P <0.05)。(2)Western blot结果显示,术后各时间点,大鼠心肌组织中焦亡经典通路相关蛋白[NOD样受体蛋白3(nucleotide-binding domain(NOD)-like receptor protein 3,NLRP3)、天冬氨酸蛋白水解酶-1 (cysteinyl aspartate-specific proteases-1,Caspase-1)、消皮素D(Gasdermin D,GSDMD)]在CLP组均显示出高表达状态,较Sham组明显升高(P <0.05),24 h组表达量最高,而ES组各时间点上述蛋白表达水平均较CLP组有所减少,且差异统计学意义(P <0.05)。(3)病理结果显示,Sham组大鼠心肌组织可见轻微的病理损伤,CLP组心肌细胞损伤最重,ES组大鼠的心肌细胞破坏较CLP组减轻程度多,各组24 h损伤程度均较6 h重。(4)24 h Tunel与DAPI染色显示,与Sham组可见的少量阳性细胞比较,CLP组可见大量被染色的阳性细胞,且差异有统计学意义(P <0.05);而与CLP组比较,ES组心肌细胞阳性染色数量明显减少(P <0.05)。(5) 7 d生存分析显示,CLP组大鼠死亡率最高,ES组大鼠生存天数较CLP组明显延长,差异有统计学意义(P <0.01)。结论 ES能减轻心肌损伤,提高脓毒症大鼠生存率,其机制可能与抑制焦亡经典通路中NLRP3/Caspase-1/GSDMD蛋白表达及减少炎症因子释放有关。

丹酚酸B对NASH细胞焦亡通路NLRP3/Caspase-1/GSDMD的影响

背景大量实验证明丹酚酸B(salvianolic acid B,Sal B)对非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)有治疗作用,细胞焦亡在NAFLD发病及其向非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)进展的过程中起了重要作用,通过研究Sal B对NASH细胞焦亡主要相关蛋白的调节,发觉Sal B在NAFLD中多途径、多靶点的治疗作用及优势.目的建立NASH体外细胞模型,并用Sal B及焦亡抑制剂(VX-765)干预,探讨Sal B对细胞焦亡的影响及对焦亡通路GSDMD/NLRP3/Caspase-1的调节机制.方法取对数生长期HepG2细胞,MTT法检测筛选棕榈酸(palmitic acid,PA)最佳的药物干预浓度及干预时间;将细胞随机分为对照组、模型组(PA),治疗组(Sal B+PA)及抑制剂组(VX-765+PA).取各组细胞分别经油红O染色在光学显微镜观察细胞内脂质蓄积情况,收集细胞上清液酶标仪下测定光密度(optical density,OD)值;免疫荧光H2DCFH探针测定细胞内活性氧含量;酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA)检测各组细胞上清液白细胞介素-18(interleukin 18,IL-18)、白细胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)表达量;Western Blot检测炎性小体核苷酸寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)及焦亡相关蛋白半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、消皮素(gasdermin D,GSDMD)、GSDMD的N端结构域(GSDMD-N)的表达,并检测各种蛋白的相对表达量变化.结果模型组细胞内脂质小体及活性氧(reactive oxygen species,ROS)蓄积明显,IL-1β、IL-18等促炎因子分泌增多(P值<0.05),炎症小体NLRP3、焦亡相关蛋白Caspase-1、GSDMD、GSDMD-N表达均升高(P值均<0.05).使用Sal B干预治疗或VX-765抑制剂处理后可逆转PA造成的脂质及ROS蓄积,IL-1β及IL-18炎症因子的分泌,同时可下调NLRP3、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-N等焦亡相关蛋白表达(P值均<0.05).结论PA可诱导肝脏细胞焦亡发生,丹酚酸B通过对焦亡通路NLRP3/Caspase-1/GSDMD的抑制作用减轻炎症反应,缓解NASH进展.

基于NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路探讨补中益气汤干预NOD.H-2^(h4)小鼠AIT细胞焦亡的机制

目的:基于NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)/胱天蛋白酶-1(Caspase-1)/消皮素D(GSDMD)通路探讨补中益气汤对自身免疫性甲状腺炎(AIT)小鼠细胞焦亡的作用机制。方法:60只NOD.H-2h4小鼠分为正常组、模型组、补中益气汤低、中、高剂量(4.10、8.19、16.38 g·kg^(-1))组和硒酵母片(0.26 mg·kg^(-1))组,每组10只。除正常组外,其余各组均给予0.05%碘化钠(NaI)灌胃8周造模,继续给药干预8周。酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清甲状腺过氧化物酶抗体(TPO-Ab)、甲状腺球蛋白抗体(Tg Ab)水平;苏木素-伊红(HE)染色观察小鼠甲状腺组织病理学改变;免疫组化法检测甲状腺组织中NLRP3、Caspase-1、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)蛋白表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测甲状腺组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测甲状腺组织中细胞焦亡相关蛋白水平。结果:与正常组比较,模型组小鼠血清TPO-Ab、Tg Ab水平显著升高(P<0.01),甲状腺滤泡或增大呈立方状,或破坏萎缩,滤泡周围可见大量淋巴细胞浸润;与模型组比较,给药组TPO-Ab、Tg Ab水平显著降低(P<0.01),滤泡形态结构有所改善,淋巴细胞浸润程度有所减轻,其中补中益气汤中剂量组降低和改善效果最为明显。与正常组比较,模型组小鼠甲状腺组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白阳性产物和mRNA表达显著增加(P<0.01),NLRP3、剪切的(cleaved) Caspase-1、IL-1β、IL-18、GSDMD-N蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,给药组NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白阳性产物和mRNA表达明显降低(P<0.05,P<0.01),其中补中益气汤中剂量组降低效果最为明显,给药组NLRP3、cleaved Caspase-1、IL-1β、IL-18、GSDMD-N蛋白表达水平明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论:补中益气汤可改善AIT,其机制可能是通过调控NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路抑制细胞焦亡实现的。

雷公藤多苷通过NLRP3/caspase-1/GSDMD细胞焦亡通路对糖尿病肾病大鼠肾损伤的影响

探讨雷公藤多苷(multi-glycosides of Tripterygium wilfordii,GTW)通过Nod样受体蛋白3(Nod-like receptor protein 3,NLRP3)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1(caspase-1)/消皮素D(GSDMD)细胞焦亡通路改善糖尿病肾病(diabetic kidney di-sease,DKD)大鼠肾损伤的作用和机制。将42只雄性SD大鼠随机分为正常组8只、造模组34只。造模组予以高糖高脂饮食及一次性腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ),诱导建立DKD大鼠模型。造模成功后随机分为模型组、缬沙坦(代文)组、雷公藤多苷(GTW)组。正常组及模型组灌服生理盐水,治疗组分别予以代文和GTW连续灌胃6周后,生化检测各组大鼠血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、血肌酐(serum creatinine,Scr)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、血清白蛋白(albumin,ALB)及24 h尿蛋白定量(24 hours urinary total protein,24 h-UTP)水平;苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察肾组织病理;酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测肾组织中细胞焦亡通路相关蛋白表达;RT-PCR检测肾组织中细胞焦亡通路相关基因表达。与正常组比较,模型组大鼠BUN、Scr、ALT、24 h-UTP及血清IL-1β、IL-18水平均显著升高(P<0.01),ALB显著降低(P<0.01),肾脏病理损伤较重,且肾组织NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白及其mRNA表达水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,代文组、GTW组BUN、Scr、ALT、24 h-UTP及血清IL-1β、IL-18水平均显著下降(P<0.01),ALB显著升高(P<0.01),肾脏病理改善,且肾组织NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白及其mRNA表达水平明显降低(P<0.01或P<0.05)。GTW可能通过降低NLRP3/caspase-1/GSDMD在肾组织的表达抑制细胞焦亡,缓解DKD大鼠炎症反应,减轻肾脏病理损伤。

苦柯胺B调控NLRP3/Caspase-1/GSDMD焦亡通路减轻脂多糖诱导的巨噬细胞炎症

目的:探讨苦柯胺B(KB)对脂多糖(LPS)诱导的人单核细胞白血病THP-1细胞核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)/半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)/消皮素D(GSDMD)焦亡通路的调控作用。方法:THP-1细胞经100 ng/mL佛波酯(PMA)诱导24 h成为巨噬细胞,采用CCK-8法检测KB对细胞活力的影响,确定合适的浓度用于后续实验;由LPS联合三磷酸腺苷(ATP)诱导建立巨噬细胞炎症损伤模型(LPS组),采用不同浓度KB及NLRP3炎症小体抑制剂MCC950处理细胞,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组NLRP3、Caspase-1、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、白细胞介素(IL)-1β、GSDMD及高迁移率族蛋白B1(HMGB-1)mRNA表达,采用western blotting法检测炎症小体组分及焦亡相关蛋白的表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定细胞上清液IL-1β的含量,检测细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)释放量,Annexin-V-PE/7-AAD染色检测细胞凋亡。结果:KB浓度为12.5~400μmol/L范围内对THP-1细胞活力无明显影响。与对照组(未处理细胞)比较,LPS组NLRP3、Caspase-1、IL-1β、GSDMD、HMGB-1 m RNA表达上调,经MCC950或KB处理后,上述mRNA表达水平较LPS组下降(均P<0.05)。与对照组比较,LPS组NLRP3、Caspase-1、Cleaved Caspase-1、GSDMD、GSDMD-NT、HMGB1蛋白表达量均较对照组升高,经MCC950或KB处理后上述蛋白表达下调,细胞培养上清液中IL-1β分泌量和LDH释放量降低(均P<0.05),细胞凋亡减少。结论:KB可通过抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路介导的焦亡来改善LPS诱导的THP-1细胞炎症。

三黄连合剂通过NLRP3/ASC/Caspase-1通路对哮喘患儿气道炎症的机制研究

目的探讨三黄连合剂通过NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein domain associated protein 3,NLRP3)/凋亡相关颗粒样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(cysteine aspartic acid specific protease-1,Caspase-1)通路对哮喘患儿气道炎症的作用及机制。方法选取2021年1月—2023年10月就诊的90例哮喘患儿,采用数字表法随机分为观察组与对照组,各45例。观察2组哮喘患儿不良反应、1 s用力呼气容积(forced expiratory volume in the first second,FEV_(1)%)、最大呼气流量(peak expiratory flow,PEF)、用力肺活量(forced vital capacity,FVC)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)及TNF-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表达水平差异。结果观察组不良反应发生率为6.66%,对照组为11.11%,差异无统计学意义(P>0.05)。观察组总有效率为95.56%,高于对照组的80.00%(P<0.05)。治疗后FEV_(1)%、PEF、FVC、哮喘控制测试表(asthma control test,ACT)评分高于对照组(P<0.05)。治疗后观察组血清IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、IL-18水平低于对照组(P<0.05)。治疗后观察组患儿血清NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β蛋白表达水平低于对照组(P<0.05)。结论三黄连合剂治疗能减轻哮喘患儿气道炎症反应,降低炎症因子水平,改善肺功能,减轻病情,提高疗效,其可能通过NLRP3/ASC/Caspase-1通路发挥作用。

黄芩素调控NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路介导的焦亡减轻小鼠急性肺损伤作用

目的探究黄芩素对急性肺损伤(acute lung injure,ALI)小鼠的治疗作用以及对NOD样受体热蛋白结构域3(NODlike receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(cystein-asparate protease-1,Caspase-1)/消皮素D(gasdermin D,GSDMD)焦亡通路的调控作用。方法60只雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组、Caspase1抑制剂VX-765(30 mg/kg)组和黄芩素低、中、高剂量(10、20、40 mg/kg)组,每组10只。除对照组外,其余各组ip脂多糖(lipopolysaccharide,LPS,15 mg/kg),分别于造模前24 h和造模0.5 h后给予黄芩素或VX-765(30 mg/kg)干预。造模24 h后,检测小鼠肺湿干质量比以评价肺肿胀;苏木素-伊红(HE)染色法检测肺组织病理变化;透射电子显微镜观察肺组织中巨噬细胞损伤情况;ELISA法检测小鼠血清和肺泡灌洗液中白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、IL-18、IL-1α和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平;采用Western blotting检测肺组织NLRP3、凋亡相关的斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)、cleaved Caspase-1、pro Caspase-1、GSDMD-N以及GSDMD蛋白表达。人源单核细胞白血病THP-1细胞加入100 nmol/L佛波酯诱导24 h,贴壁后随机分为对照组、模型组、VX-765(500 nmol/L)组和黄芩素低、中、高剂量(3、10、30μmol/L)组,除对照组外,采用1μg/mL LPS联合5 mmol/L三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)刺激THP-1细胞建立细胞炎症模型,给予黄芩素或VX-765干预,采用CCK-8法检测细胞活力;ELISA法检测上清液中IL-1β、IL-18和IL-1α水平;LDH试剂盒检测上清液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活力;免疫荧光评估NLRP3炎症小体组装情况;采用膜联蛋白-V-PE(Annexin-V-PE)/7-氨基放线菌素(7-aminoactinomycin,7-AAD)试剂盒评价细胞焦亡情况;Western blotting检测细胞NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路相关蛋白表达。结果在ALI小鼠模型中,与模型组比较,VX-765组和黄芩素组小鼠肺肿胀程度明显减轻(P<0.01),肺组织损伤评分显著降低(P<0.01),肺组织中巨噬细胞炎性病变得到缓解,血清及肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-18、IL1α水平明显降低(P<0.05、0.01),肺组织NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1、pro Caspase-1、GSDMD-N以及GSDMD蛋白表达水平均显著降低(P<0.05、0.01)。在细胞炎症模型中,与模型组比较,VX-765组和黄芩素组THP-1细胞IL-1β、IL18、IL-1α分泌量显著降低(P<0.01),NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路相关蛋白表达水平明显降低(P<0.05、0.01),NLRP3炎症小体组装明显被抑制(P<0.05、0.01),LDH释放量及细胞焦亡率显著降低(P<0.01)。结论黄芩素通过抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路介导的细胞焦亡,从而改善LPS诱导的小鼠ALI。

基于NLRP3/caspase-1/GSDMD通路研究黄精改善糖尿病大血管焦亡损伤的作用机制

探讨黄精调节NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)/天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,caspase-1)/消皮素D(gasdermin D,GSDMD)通路对糖尿病大血管焦亡损伤的影响。采用小剂量链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)腹腔注射联合高糖高脂饮食诱导糖尿病大鼠模型。利用血糖检测仪、全自动生化分析仪、苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色、酶联免疫吸附测定(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)、免疫荧光、免疫组织化学及Western blot等方法,检测大鼠血糖含量、血脂水平、血管厚度、炎症因子含量及焦亡相关蛋白的表达水平,评价糖尿病大血管焦亡损伤,及药物抗糖尿病大血管焦亡损伤的作用机制。结果表明,药物联合饮食诱导成功构建糖尿病模型。与对照组相比,模型组大鼠空腹血糖含量升高,血浆中总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-c)含量显著升高,高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-c)含量显著降低,血管内膜增厚,血清与主动脉中炎症因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)含量增加,炎症小体NLRP3表达增加,主动脉血管细胞中caspase-1、GSDMD活化蛋白增加。与模型组相比,黄精干预可降低血糖、血脂含量,抑制血管增厚,减少糖尿病大鼠血清及主动脉炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-18表达,抑制炎症小体NLRP3表达以及焦亡相关蛋白caspase-1、GSDMD的活化。综上所述,黄精可通过抑制细胞焦亡,减轻血管局部炎症,延缓糖尿病大血管焦亡损伤进程。

冠心宁片抑制NLRP3/ASC/Caspase-1通路改善阿霉素诱导的扩张型心肌病大鼠心肌细胞焦亡

目的 研究冠心宁片(Guanxinning, GXN)对扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy, DCM)的保护作用,并从NLRP3/ASC/Caspase-1通路深入探讨其对心肌细胞焦亡的作用机制。方法 随机将大鼠分为GXN低剂量组、GXN高剂量组、地高辛组、模型对照组和正常对照组,通过阿霉素(doxorubicin, DOX)累积注射17.5 mg/kg诱导大鼠DCM模型,同时连续给药10周。超声心动图检测心功能指标,ELISA检测血清IL-1β和IL-18水平,RT-PCR法检测心肌组织NLRP3、ASC、Caspase-1、NF-κB、TXNIP、IL-1β和IL-18的mRNA表达,免疫组化、免疫荧光染色和Western Blot检测NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18、GSDMD、GSDMD-NT的蛋白表达及TUNEL染色结果,透射电镜观察心肌细胞显微结构的变化。结果 与正常对照组比,模型对照组的IVSs、IVSd、LVPWs、FS、SV、EF和HR显著降低,LVIDs、ESV及血清IL-1β、IL-18显著增加,NLRP3、ASC、Caspase-1、NF-κB、TXNIP、IL-1β和IL-18的mRNA表达均显著增加,NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18、GSDMD-NT的蛋白表达及TUNEL染色面积明显增加,显微结构明显改变。与模型对照组相比,冠心宁片可显著增加IVSs、SV、FS、EF和HR,显著降低LVIDs、ESV和血清IL-1β、IL-18水平,降低心衰大鼠的NLRP3、ASC、Caspase-1、NF-κB、TXNIP、IL-1β、IL-18的mRNA和NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18、GSDMD-NT的蛋白水平及TUNEL染色面积,显微结构明显改善。结论 冠心宁片可以有效改善阿霉素诱导的扩张型心肌病,可能是通过抑制NLRP3/ASC/Caspase-1通路改善扩张型心肌病大鼠的心肌细胞焦亡实现的。

艾灸抑制NLRP3/Caspase-1通路介导的细胞焦亡减轻脑缺血再灌注损伤

背景:研究发现,艾灸能抑制脑缺血/再灌注损伤大鼠血清中的炎症因子,对抗氧化应激,抑制细胞凋亡,有效减轻脑缺血/再灌注损伤。目的:观察艾灸干预不同时间后脑缺血/再灌注损伤模型大鼠核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎性小体、半胱氨酸天冬氨酸酶1(cysteine aspartase,caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、消皮素D(GSDMD)及白细胞介素1β、白细胞介素18表达的变化,并探讨其作用机制。方法:SD大鼠随机分为假手术组9只和造模组36只,造模组制备大脑中动脉栓塞大鼠模型。造模成功后将造模组大鼠进一步分为模型组、艾灸10 min组、艾灸15 min组、艾灸30 min组,每组9只。艾灸10 min、15 min和30 min组大鼠分别给予艾灸悬灸“百会、大椎、足三里”穴,均干预1次/d,共干预7 d。采用LONGA法评估大鼠神经功能缺损情况,TTC法观察脑组织梗死情况,苏木精-伊红染色观察脑组织病理改变,ELISA法检测血清中白细胞介素1β、白细胞介素18水平,免疫组织化学法和蛋白免疫印迹法测定脑皮质缺血区组织NLRP3、caspase-1、凋亡相关斑点样蛋白、消皮素D蛋白的表达。结果与结论:(1)与假手术组比较,模型组大鼠神经功能缺损评分显著升高(P <0.01),与模型组比较,艾灸各组大鼠神经功能缺损评分明显降低(P <0.01);(2)与假手术组比较,模型组大鼠脑梗死体积明显增大(P <0.01),与模型组比较,艾灸各组大鼠脑梗死体积明显减少(P <0.01),艾灸30 min组脑梗死体积最小(P <0.05);(3)与模型组比较,艾灸各组大鼠血清白细胞介素1β、白细胞介素18水平下降(P <0.01),与艾灸10 min组比较,艾灸30 min组血清中的炎症因子水平明显下降(P <0.05);(4)与模型组比较,艾灸各组大鼠皮质缺血区NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白、Caspase-1、消皮素D蛋白表达显著降低(P <0.01),艾灸30 min组蛋白表达明显低于艾灸10 min组和艾灸15 min组(P <0.05);(5)结论:艾灸百会、大椎、足三里可减轻脑缺血/再灌注损伤,其中艾灸30 min疗效最佳,其机制可能与抑制NLRP3/Caspase-1通路介导的细胞焦亡有关。

右美托咪定介导NLRP3/caspase-1/GSDMD信号通路改善七氟烷致老年大鼠认知功能障碍

目的观察右美托咪定(DEX)对七氟烷所致大鼠认知功能障碍及对NLRP3/caspase-1/GSDMD信号通路的影响。方法32只SD大鼠随机分为对照组(C组)、七氟烷组(M组)、右美托咪定低、高剂量组(DL、DH组)。旷场实验和Morris水迷宫实验测定认知功能;HE染色观察海马区神经元形态;Nissl染色观察海马区神经元数量;ELISA测定海马组织中SYP和PSD-95的表达量;Western blot法测定海马组织中NLRP3、Caspase-1和GSDMD-N蛋白含量。结果与M组比较,DL组和DH组站立次数和穿越平台次数明显增加,活动总路程明显增加,海马区神经元形态和数量得到明显改善,SYP和PSD-95浓度明显升高,NLRP3、Caspase-1和GSDMD-N蛋白含量明显降低。结论DEX可通过抑制NLRP3/caspase-1/GSDMD信号通路改善七氟烷麻醉所致的认知功能障碍。

鼻咽癌组织中细胞焦亡相关蛋白NLRP3/Caspase-1/GSDMD表达以及同复发转移关系研究

目的探究NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(Nod-like receptor protein 3,NLRP3)、半胱天冬氨酸蛋白酶1(cysteine-aspartic acid protease 1,Caspase-1)和消皮素D(Gasdermin D,GSDMD)在鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)中的表达以及其同NPC复发转移的关系。方法回顾性分析2014年12月至2020年1月黄石市中心医院确诊为NPC的421例病例资料,其中男262例,女159例,年龄18~88岁。通过免疫组化和多重免疫荧光染色法观察NLRP3、Caspase-1和GSDMD在病理标本中的表达。结合随访资料,应用单因素和多因素Cox回归分析NPC复发转移的影响因素。此外,使用NPC细胞系HNE-2进行体外实验,探究NLRP3、Caspase-1和GSDMD的功能机制。结果多因素分析显示,Ⅲ~Ⅳ期肿瘤分期(HR_(复发)=2.74,95%CI_(复发):1.61~4.65;HR_(转移)=1.90,95%CI_(转移):1.04~3.49)和治疗前血浆EBV-DNA≥1500 copies/ml(HR_(复发)=1.91,95%CI_(复发):1.13~3.23;HR_(转移)=2.07,95%CI_(转移):1.23~3.50)是NPC患者发生复发和转移的独立危险因子,而NLRP3(HR_(复发)=0.17,95%CI_(复发):0.08~0.35;HR_(转移)=0.30,95%CI_(转移):0.15~0.59)、Caspase-1(HR_(复发)=0.32,95%CI_(复发):0.18~0.59;HR_(转移)=0.43,95%CI_(转移):0.25~0.76)和GSDMD(HR_(复发)=0.48,95%CI_(复发):0.25~0.91;HR_(转移)=0.96,95%CI_(转移):0.53~1.74)的阳性表达则是独立保护因子;年龄(HR=1.02,95%CI:1.01~1.04)和调强放疗(HR=0.51,95%CI:0.30~0.88)是NPC患者复发独立影响因子,化疗(HR=0.50,95%CI:0.29~0.88)则是NPC转移的独立保护因子(P值均<0.05)。三者阳性表达的NPC患者局部-区域性无复发生存期、远处无转移生存期以及总生存期均高于三者阴性表达者(P值均<0.05)。体外实验中,蛋白免疫印迹法(WB)分析揭示,NLRP3的过表达可以激活NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路。酶联免疫吸附试验和扫描电镜显示,NLRP3的过表达能促进HNE-2细胞的焦亡。细胞功能分析进一步证实,NLRP3的过表达能显著抑制HNE-2细胞的增殖、侵袭和转移能力。结论NLRP3、Caspase-1和GSDMD表达阳性是NPC患者复发转移的独立保护因子,能够通过促进细胞焦亡发生而抑制NPC增殖、侵袭和转移。