干扰HSF2对THP-1细胞NLRP3炎症复合体的影响

目的:通过慢病毒-热休克转录因子2-RNA干扰(lentivirus-heat shock transcription factor2-RNA interference,LV-HSF2-RNAi)人巨噬细胞系(THP-1),探讨HSF2对THP-1细胞NOD样受体3(NOD-like receptor family,pyrin domain containing 3,NLRP3)炎症复合体及其下游白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的影响.方法:选用THP-1作为研究对象,使用慢病毒(LV-HSF2-RN Ai)转染THP-1,干扰其HSF2表达,使用佛波醋(phorbol 12-myristate13-acetate,PMA)诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞;将细胞分为对照组与转染组,使用脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)刺激细胞凝胶电泳PCR检测细胞NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis associated speck-like protein containing a CADR domain,ASC)、半胱氨酸蛋白酶-1(cysteine-requiring aspartate protease-1,Caspasel)、IL-1βmRNA表达:蛋白质免疫印迹实验(Western blot)检测细胞NLRP3、ASC、Caspasel、IL-1β蛋白表达:酶联免疫吸附测定(ELISA)检测细胞培养基内IL-1β水平.结果:Western blot检测HSF2干扰组中HSF2蛋白表达明显低于未转染组和阴性对照组(P<0.05);PMA诱导THP-1细胞分化,LPS刺激后,干扰组NLRP3、ASC、Caspasel、IL-1βmRNA及蛋白表达水平明显高于对照组及干扰对照组(P<0.05);HSF2干扰组IL-1β表达水平明显高于未转染组及阴性对照组(538.800 pg/mL±52.250 pg/mL vs 257.010pg/mL±26.148 pg/mL,238.231 pg/mL±29.245 pg/mL,P<0.05).结论:干扰HSF2可以明显提高THP-1细胞NLRP3炎症复合体活化水平,提高IL-1β水平.

幽门螺杆菌经ROS通路激活NLRP3炎症复合体诱导THP-1细胞分泌IL-1β和IL-18

目的:研究幽门螺杆菌(H.pylori)对NLRP3炎症复合体活化的影响及活性氧(ROS)在其中的作用。方法:将THP-1细胞与H.pylori SS1共孵育,于不同时间点收集细胞及上清,ELISA检测细胞上清中IL-1β和IL-18的含量;流式细胞术(FCM)检测胞内ROS的产生;实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测细胞中NLRP3、caspase-1 mRNA的表达;Western blot检测细胞中caspase-1活性亚单位p10的表达;检测ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)及NLRP3特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)预处理细胞后相关信号分子的表达。结果:H.pylori SS1能以时间依赖性和剂量依赖性方式诱导THP-1细胞产生IL-1β、IL-18和胞内ROS;H.pylori SS1刺激能使THP-1细胞NLRP3和caspase-1 mRNA转录水平显著升高;NAC及NLRP3-siRNA预处理THP-1细胞能显著降低H.pylori SS1诱导的NLRP3炎症复合体相关成份的表达及细胞因子的分泌。结论:H.pylori SS1株通过ROS途径激活NLRP3炎症复合体诱导THP-1细胞分泌IL-1β和IL-18,这可能与机体的先天免疫防御及细菌的致病作用相关。

NLRP3炎症复合体与疾病相关性研究进展

NLRP3炎症复合体是近年发现的重要炎症复合体之一,与机体的免疫炎症密切相关,可以识别多种病原体和损伤信号,在许多疾病的发生发展中发挥着重要作用。本文简述了NLRP3炎症复合体及其在疾病发生发展中的研究进展。

TLR4/NLRP3炎症复合体介导对比剂诱导的肾小管上皮细胞炎症和损伤

目的:探讨Toll样受体4(TLR4)/Nod样受体蛋白3(NLRP3)炎症复合体是否介导了对比剂(CM)引起的肾小管上皮细胞炎症和损伤。方法:本研究运用碘普罗胺作用于大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E建立损伤模型。应用CCK-8法测定细胞存活率;Western blot测定TLR4、NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、caspase-1和cleaved caspase-3的蛋白水平;ELISA法检测炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)和IL-18的水平;Hoechst 33258核染色法检测凋亡率;JC-1染色法测定线粒体膜电位。用小干扰RNA沉默NLRP3表达。结果:CM可降低NRK-52E细胞的存活率并上调cleaved caspase-3的蛋白水平(P<0.05);此外,CM可上调细胞TLR4/NLRP3炎症复合体的表达并促进炎症因子IL-1β和IL-18的分泌(P<0.05)。沉默NLRP3可以对抗CM诱导的炎症因子分泌;TLR4抑制剂TAK-242及沉默NLRP3能减轻CM引起的细胞凋亡和线粒体功能损伤。结论:TLR4/NLRP3炎症复合体参与了CM致急性肾损伤的发病机制,并介导了CM诱导的肾小管上皮细胞损伤和炎症。

酒精性肝病患者肝组织NLRP3炎症复合体基因水平检测及其意义

目的探讨核苷酸结合性寡聚区蛋白样受体(NLR)P3炎症复合体在酒精性肝病(ALD)发病中的作用。方法本研究获得酒精性肝炎(AH)12例、酒精性肝硬化(ALC)4例和健康人(HC)12例肝组织,采用RT-PCR法检测肝组织NLRP3、Caspase-1和IL-1βm RNA水平。采集ALD患者84例【AH20例、ALC48例(Child-Pugh A级19例、B级22例和C级7例)和重症酒精性肝炎(SAH)16例】和健康人40例血浆,采用ELISA法检测血浆IL-1β水平,采用Spearman秩相关分析血浆IL-1β水平与临床检验指标的相关性。结果 AH和ALC患者肝组织NLRP3 m RNA水平分别为(28.1±2.8)和(28.4±3.1),均显著高于HC组【(8.8±1.8),P<0.001】,Caspase-1m RNA水平分别为(18.8±1.2)和(24.6±1.8),均显著高于HC组【(15.1±1.0),P<0.05】,IL-1βm RNA水平分别为(17.0±2.9)和(16.3±4.4),均显著高于HC组【(7.0±1.1),P<0.01】;肝组织NLRP3 m RNA水平分别与IL-1βm RNA或Caspase-1 m RNA水平呈正相关(P<0.05);AH、ALC和SAH患者血浆IL-1β水平分别为(36.1±1.8)pg/m L、(28.0±1.6)pg/m L和(32.5±2.4)pg/m L,均显著高于HC组【(14.7±0.8)pg/m L,P<0.01】;不同Child-Pugh分级ALC患者IL-1β水平无显著性差异(P>0.05);ALD患者血浆IL-1β水平与ALT和AST/ALT比值呈正相关。结论 NLRP3炎症复合体主要组分及促炎细胞因子IL-1β在ALD患者肝组织和血浆水平升高,可能参与了ALD发病的炎症反应过程。

麝香酮对胰腺癌中NLRP3炎症体通路介导的上皮间质转化的影响

目的探讨麝香酮(MUS)对胰腺癌(PC)的抗癌作用及其对核苷酸结合寡化结构域样受体3(NLRP3)炎症体通路和上皮间质转化(EMT)的影响。方法根据MUS处理浓度不同将人胰腺癌细胞(PANC1)细胞分为0μM组、0.1μM组、0.5μM组、1μM组、2μM组和4μM组,各组细胞使用相应浓度的MUS孵育48 h。使用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定生长抑制率和半抑制浓度(IC50)值,使用Annexin V-FITC/PI染色法测定细胞凋亡,使用Transwell测定细胞迁移和侵袭。使用Western blot测定Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤(Bcl-2)、基质金属蛋白酶(MMP2)、MMP9、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、NLRP3、半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)和血清人细胞凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的蛋白表达水平。通过对BALB/c雄性裸鼠皮下注射PANC1细胞构建移植瘤模型,然后将裸鼠随机分为对照组和MUS组,每组6只。对照组裸鼠给予腹腔注射100μL的1%二甲基亚砜(DMSO),MUS组裸鼠给予腹腔注射100μL的MUS溶液(20 mg/kg)。给药21 d后测量裸鼠肿瘤体积和重量。结果与0μM组相比,0.1μM组、0.5μM组、1μM组、2μM组和4μM组的PANC1细胞的生长抑制率逐渐升高,凋亡率逐渐升高(均P<0.05),Bax蛋白表达水平逐渐升高,Bcl-2蛋白表达水平逐渐降低(P<0.05)。与0μM组相比,0.1μM组、0.5μM组、1μM组、2μM组和4μM组的迁移和侵袭细胞数逐渐降低(P<0.05),MMP2和MMP9蛋白表达水平逐渐降低(P<0.05)。与0μM组相比,0.1μM组、0.5μM组、1μM组、2μM组和4μM组的E-cadherin蛋白表达水平逐渐升高,N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平逐渐降低(P<0.05),NLRP3、caspase-1和ASC蛋白表达水平逐渐降低(P<0.05)。与对照组比较,MUS组裸鼠的肿瘤体积和重量均降低(P<0.05),肿瘤组织中的NLRP3、caspase-1和ASC蛋白表达水平均降低(P<0.05)。结论MUS具有良好的抗PC作用,可能通过抑制NLRP3炎症体通路介导的EMT发挥抗癌作用。

脂肪间充质干细胞外泌体调控心脏成纤维细胞自噬和NLRP3炎症小体平衡抑制心肌梗死后不良心室重塑

[目的]探讨脂肪间充质干细胞(ADMSC)外泌体(Exo)对心肌梗死(MI)后不良心室重塑的抑制作用和机制。[方法]观察心脏成纤维细胞经过氧化氢(H_(2)O_(2))处理后自噬和炎症表型的改变。MI大鼠经尾静脉注射等体积的生理盐水、ADMSC外泌体(MSC-Exo)、成纤维细胞外泌体(MEF-Exo),观察心脏成纤维细胞自噬相关16样蛋白1(ATG16L1)、自噬相关蛋白7(ATG7)和NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体的表达,炎症反应,心肌纤维化程度以及心功能。[结果]心脏成纤维细胞经H_(2)O_(2)处理后,自噬相关蛋白ATG16L1和ATG7表达显著降低(P<0.001),NLRP3表达显著升高(P<0.001),促炎细胞因子白细胞介素1β(IL-1β)和IL-18水平显著增加(P<0.001)。MI大鼠经MSC-Exo干预后,自噬相关蛋白ATG16L1和ATG7表达显著上调(P<0.001),NLRP3表达显著下调(P<0.001),血清IL-1β和IL-18水平显著降低(P<0.001),纤维化相关蛋白胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ显著减少(P<0.001),心肌纤维化程度显著减轻(P<0.001),心功能明显改善(P<0.001)。[结论]脂肪MSC-Exo通过调控心脏成纤维细胞自噬和NLRP3炎症小体的平衡,发挥抑制MI后不良心室重塑的作用。

解毒化瘀颗粒对急性肝衰竭大鼠NLRP3炎症体调控作用的实验研究

目的:观察解毒化瘀颗粒对急性肝衰竭大鼠NLRP3炎症体的调控作用,探索解毒化瘀颗粒治疗急性肝衰竭的作用机制。方法:SPF级SD大鼠36只,随机分为解毒化瘀颗粒组12只、模型组12只和空白对照组12只。解毒化瘀颗粒组和模型组大鼠给予腹腔注射D-GalN 600mg/kg和LPS 20μg/kg制备急性肝衰竭大鼠模型,空白对照组给予腹腔注射等体积生理盐水。造模前1周开始灌胃给药,解毒化瘀颗粒组给予解毒化瘀颗粒灌胃,模型组与空白对照组给予等体积生理盐水灌胃。于造模成功后第3天取材,采集血液标本及大鼠肝组织,HE染色观察,运用Western Blot、qPCR检测肝组织中NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白和mRNA表达情况;运用ELISA检测血清IL-1β、IL-18表达情况。结果:解毒化瘀颗粒组大鼠血清IL-1B、IL-18水平低于模型组,差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组对比,解毒化瘀颗粒组大鼠肝组织中NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白及mRNA表达量降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:解毒化瘀颗粒能够下调NLRP3炎症体NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β和IL-18等相关因子的表达,对急性肝衰竭具有一定的治疗作用。

小胶质细胞NLRP3炎症体激活在锰诱导神经功能损伤中的作用

目的揭示亚急性锰染毒诱导的小胶质细胞对小鼠中枢神经的损伤效应,阐明核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体在其中的关键作用及机制。方法将C57BL/6小鼠和NLRP3^(-/-)小鼠各随机分为2组,每组12只,共4组,即对照组、锰组(Mn组)、NLRP3^(-/-)组和NLRP3^(-/-)+Mn组。Mn组和NLRP3^(-/-)+Mn组在第1、4、7、10、13日时,采用皮下注射(100 mg/kg)的方式进行锰暴露,对照组和NLRP3^(-/-)组给予相同体积生理盐水。运用行为学检测法观察小鼠运动能力改变情况;运用免疫组织化学TH染色法观察小鼠脑组织神经元形态学的改变;运用原子吸收法对各组小鼠血锰含量进行检测;通过qRT-PCR法检测小胶质细胞活化相关标志物IL-18、IL-1β的mRNA表达水平;通过免疫荧光染色实验检测纹状体区内小胶质细胞的激活情况。使用Western blotting检测NLRP3相关蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β的表达情况。结果与对照组相比,Mn组小鼠运动协调能力明显损伤(P<0.05),黑质区神经元细胞数量明显降低(P<0.05),小胶质细胞明显发生活化(P<0.05),NLRP3及其相关分子NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β蛋白表达水平增高(P<0.05)。NLRP3敲除后,锰暴露所诱导小鼠运动协调能力下降显著回升(P<0.05),且可以逆转锰暴露所诱导的神经元损伤、小胶质细胞活化和NLRP3相关分子蛋白水平表达增加(P<0.05)。结论锰暴露可能通过诱导小鼠纹状体区小胶质细胞活化,促神经功能损伤;特异性敲除NLRP3基因后,可以抑制锰暴露引起的小胶质细胞活化和神经功能的损伤,起到显著的神经功能保护作用。

NLRP3炎症复合体与糖尿病慢性难愈性创面关系的研究进展

炎症复合体是近年来发现的一种胞内多蛋白复合体,由NOD样受体(NLR)家族成员或黑素瘤缺乏因子2(AIM2)与凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、caspase-1组成。NLRP3炎症复合体作为固有免疫系统的重要组分,在多种炎症性疾病的发生发展过程中起重要作用。糖尿病慢性创面的持续感染和高促炎状态可活化创面巨噬细胞的NLRP3炎症复合体,激活胱天蛋白酶caspase-1,促进白细胞介素1β、白细胞介素-18、白细胞介素-33等促炎因子的成熟和释放,形成持续扩大的炎症反应,是导致糖尿病创面愈合延迟甚至不愈的主要原因之一。

NLRP3炎性小体调控慢性牙周炎的研究进展

核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide-binding oligomerization domain,NOD)样受体家族含pyrin结构域蛋白3(nod-like receptor family pyrin domain-containing protein 3,NLRP3)炎性小体是一类位于细胞质内的多蛋白复合物,可介导多种炎症性疾病。牙周致病菌可通过活化NLRP3炎性小体,调控牙周组织的慢性炎症性反应。本文对慢性牙周炎(chronic periodontitis,CP)常见病原菌活化NLRP3炎性小体的机制进行综述,旨在为深入探索CP的发病机制提供新的思路,指导临床预防和治疗慢性牙周病。

二甲双胍调节高糖环境下人牙周膜细胞NLRP3炎症小体激活的机制研究

目的 本研究拟通过体外构建伴糖尿病牙周炎模型,探索二甲双胍对人牙周膜细胞(periodontal ligament cells,PDLCs)中NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)炎症小体活化的调节能力及其机制,为二甲双胍治疗伴糖尿病牙周炎患者提供新的见解。方法 甲基噻唑基四氮唑比色法检测二甲双胍对人PDLCs的细胞毒性。将人PDLCs细胞分为5组,A组为正常葡萄糖浓度组(8 mmol/L葡萄糖),B组为高渗环境组(8 mmol/L葡萄糖+17 mmol/L的甘露醇),C组为高浓度葡萄糖组(25 mmol/L葡萄糖),D组为高糖环境下二甲双胍处理组(25 mmol/L葡萄糖+40 mmol/L二甲双胍),E组为高糖环境下二甲双胍和AMPK抑制剂处理组(25 mmol/L葡萄糖+40 mmol/L二甲双胍+10μmol/L复合物C)。A~E组均暴露在牙龈卟啉单胞菌LPS下,酶联免疫吸附试验检测促炎细胞因子白细胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-18表达水平,免疫印迹观察蛋白NLRP3、Caspase-1、ASC、AMPK、p-AMPK表达水平,同时检测线粒体复合体Ⅰ活性变化。结果 二甲双胍浓度不高于40 mmol/L时,对人PDLCs无明显细胞毒性;二甲双胍治疗可显著抑制高糖环境下细胞炎症反应,人PDLCs IL-1β和IL-18分泌减少,NLRP3、Caspase-1表达降低,同时线粒体复合体Ⅰ活性下降,p-AMPK表达升高,引入AMPK抑制剂后可部分逆转上述变化。结论 在人PDLCs中,二甲双胍通过降低线粒体复合体Ⅰ活性和激活AMPKs途径减少高糖环境中NLRP3炎症小体的激活,这为二甲双胍防治伴糖尿病牙周炎提供了新的证据。

NLRP3炎症复合体在高糖培养的肾小管上皮细胞中的表达及其与细胞凋亡的关系

目的研究NLRP3炎症复合体在高糖培养的大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)中的表达及其与细胞凋亡的关系。方法将NRK-52E细胞分为正常组、等高对照组、高糖组、高糖+阴性对照组及高糖+干扰组。培养48h后应用Western blot检测各组NLRP3,凋亡相关斑点样蛋白(ASC)及天冬氨酸蛋白水解酶1、3(Caspase-1、3)的表达情况。细胞凋亡情况采用流式细胞仪检测。结果高糖刺激可上调NRK-52E细胞NLRP3炎症复合体的表达及Caspase-3的表达(P均<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05);通过特异性的SiRNA抑制NLRP3蛋白质的表达后,细胞NLRP3炎症复合体及Caspase-3的表达均减少,细胞凋亡率下降(P均<0.05)。结论高糖促进NRK-52E细胞NLRP3炎症复合体表达,针对NLRP3的SiRNA通过减少NLRP3炎症复合体的表达从而抑制高糖诱导的细胞凋亡。

骨髓间充质干细胞外泌体调控NLRP3炎性小体对糖尿病大鼠牙槽骨缺损的机制研究

目的 探究骨髓间充质干细胞外泌体通过调控NLRP3炎性小体信号通路影响糖尿病大鼠牙槽骨缺损愈合相关分子机制。方法 选取50只SD大鼠纳入研究,随机选取10只大鼠作为对照组,其余大鼠构建糖尿病+双侧上颌牙槽骨缺损模型,设置模型组、骨髓间充质干细胞外泌体组(BMMSC-Exos组)、MCC950组(NLRP3抑制剂)、BMMSC-Exos+MCC950组,其中BMMSC-Exos组、MCC950组、BMMSC-Exos+MCC950组SD大鼠分别尾静脉注射BMMSC-Exos及MCC950试剂,模型组注射等量盐水。模型构建28d后取大鼠上颌骨组织。TEM检测BMMSC-Exos形态,Westernblot检测BMMSC-Exos标志性蛋白CD9、CD63、CD81表达。检测各组大鼠空腹血糖水平、HE染色分析各组大鼠牙槽骨炎性浸润及Lance-Sandhu评分;Western blot检测各组大鼠牙槽骨组织内NLRP3炎性小体信号通路关键蛋白(NLRP3、caspase-1、IL-1β)、骨代谢关键蛋白(OPG、ALP、Collal)表达。结果 BMMSC-Exos直径大小在100 nm左右,呈双凹圆盘状态,膜结构完整;与纯BMMSCs相比,BMMSC-Exos标志物蛋白CD9、CD63、CD81的含量表达明显提升(P <0.05)。糖尿病大鼠模型建立成功,BMMSC-Exos干预、NLRP3抑制剂(MCC950)下调大鼠血糖水平(P <0.05);两者联合可以进一步下调大鼠血糖水平(P <0.05);与对照组相比,糖尿病牙槽骨缺损模型建立可以下调骨再生Lane-Sandhu评分、OPG、ALP、Collal的表达(P <0.05),上调NLRP3、caspase-1、IL-1β表达(P <0.05);BMMSC-Exos干预可以再次上调Lane-Sandhu评分及OPG、ALP、Collal蛋白表达(P<0.05),下调NLRP3、caspase-1、IL-1β的表达(P <0.05)。与模型组相比,BMMSC-Exos及MCC950干预后大鼠骨再生Lane-Sandhu评分、骨代谢关键蛋白(OPG、ALP、Collal)的表达提升(P<0.05);两者联合可进一步上调大鼠骨再生Lane-Sandhu评分及骨代谢关键蛋白表达(P <0.05)。结论 骨髓间充质干细胞外泌体通过抑制NLRP3炎症小体活性来改善糖尿病牙槽骨缺损大鼠骨代谢,降低炎症反应,促进骨缺损的愈合。

硫化氢抑制NLRP3炎症小体活化和炎症反应改善APP/PS1小鼠认知功能

目的观察硫化氢(hydrogen sulfide,H_(2)S)对β-淀粉样前体蛋白/早老素1(amyloid precursor protein/presenilin1,APP/PS1)阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)模型小鼠认知功能的影响,并探讨其可能的机制。方法选取24只8月龄雄性APP/PS1双转基因小鼠,随机分为APP/PS1组(腹腔注射生理盐水)和APP/PS1+NaHS(H_(2)S供体)组(腹腔注射NaHS溶液);将24只8月龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为WT组(腹腔注射生理盐水)和WT+NaHS组(腹腔注射NaHS溶液)。采用Morris水迷宫实验检测小鼠空间学习记忆能力,尼氏染色观察神经元形态学变化,免疫荧光染色检测NOD样受体3(nod-like receptor protein3,NLRP3)分布及表达情况,ELISA法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)的含量,Western blot检测神经元特异性核蛋白(neuron-specific nuclear protein,NeuN)和突触素(synaptophysin,SYP)蛋白表达。结果与WT组相比较,APP/PS1组小鼠逃避潜伏期延长,平台穿越次数明显减少(P<0.05);NLRP3表达显著增加(P<0.05),TNF-α、IL-1β和IL-6含量明显升高(P<0.05);尼氏体密度、NeuN和SYP蛋白表达水平降低(P<0.05)。与APP/PS1组比较,APP/PS1+NaHS组小鼠逃避潜伏期缩短,平台穿越次数增加(P<0.05);NLRP3及促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量显著降低(P<0.05);尼氏体密度、NeuN和SYP表达水平明显升高(P<0.05)。结论H_(2)S能够改善APP/PS1小鼠认知功能,其作用机制可能与抑制NLRP3炎症小体激活,抑制神经炎症反应,减轻神经元损伤有关。

硫化氢通过调控NLRP3炎症复合体对抗对比剂诱导的急性肾损伤

目的探讨对比剂诱导的急性肾损伤(contrast-induced acute kidney injury,CIAKI)中内源性硫化氢水平是否发生变化,补充硫化氢是否可下调Nod样受体蛋白3(Nod-like receptor protein 3,NLRP3)炎症复合体从而保护肾小管上皮细胞对抗对比剂所致的肾损伤。方法24只体重180~220 g清洁级健康雄性Sprague-Dawley大鼠按随机数字表法分为对照组、CIAKI组(碘普罗胺2.9 g/kg)及CIAKI+NaHS组(NaHS 4 mg/kg处理3 d后予碘普罗胺2.9 g/kg)组,每组8只。对肾组织进行全转录组测序及生物信息学分析,HE、PAS染色观察肾组织病理改变,TUNEL法检测肾小管上皮细胞损伤情况,免疫荧光染色检测肾组织炎症复合体NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain,ASC)、caspase-1的表达。在人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)中探讨硫化氢在对比剂(碘普罗胺200 mgI/ml)诱导的细胞损伤中的作用,CCK-8法测定细胞存活率。结果与对照组相比,CIAKI组大鼠内源性硫化氢合成酶相关基因胱硫醚-β-合成酶(CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)和3-巯基丙酮酸硫转移酶(3-MST)水平下降(均P<0.05)。CBS、CSE和3-MST基因表达水平与肾功能临床生化指标血肌酐、尿素氮和胱抑素C水平呈负相关(均P<0.05)。与CIAKI组比较,CIAKI+NaHS组大鼠血肌酐、尿素氮及胱抑素C水平较低,肾脏病理改善,肾小管上皮细胞焦亡减少,肾组织炎症复合体NLRP3、ASC、caspase-1的水平较低(均P<0.05)。在HK-2细胞中,对比剂+NaHS组细胞存活率高于对比剂组;应用CBS抑制剂减少内源性硫化氢水平,对比剂诱导的HK-2细胞存活率进一步降低(P<0.05)。结论内源性硫化氢系统受损是CIAKI发病的关键环节,上调硫化氢水平可改善CIAKI大鼠的肾损伤,其保护机制与调节NLRP3炎症复合体相关。

NLRP3炎症复合体的体外构建

为体外构建NLRP3炎症复合体,利用PCR方法扩增目的基因NLRP3、IL-1β、ASC和Pro-Caspase-1,分别连接到相应的载体中,构建重组真核表达质粒p3XFLAG-NLRP3、pEGFP-C1-ASC、pEGFP-C1-IL-1β、PCI-CASP-HA,利用Lipofectamine2000试剂转染到HEK293T细胞后,采用Western blot方法验证各蛋白的表达情况;通过质粒共转染体外构建NLRP3炎症复合体,采用ELISA方法检测IL-1β生成情况。结果显示,3XFLAG-NLRP3、pEGFP-C1-ASC、pEGFP-C1-IL-1β、PCI-CASP-HA重组质粒均被成功构建,各蛋白于HEK293T细胞内均被成功表达;质粒共转染后ELISA检测到高水平的IL-1β生成,表明NLRP3炎症复合体体外构建成功。NLRP3炎症复合体在体外的成功构建,为进一步研究其激活机制奠定了基础。

白介素-4抑制HMGB1介导的小胶质细胞NLRP3炎症复合体形成的机制研究

目的 探讨白介素-4（IL-4）抑制高迁移率族蛋白1（HMGB1）介导的小胶质细胞NOD样受体蛋白3（NLRP3）炎症复合体形成的相关机制。方法 培养提取原代小胶质细胞，设置梯度浓度HMGB1（100、200、400 ng/mL）作用3 h，通过免疫荧光染色、Western blotting实验检测HMGB1对NLRP3炎症复合体及下游核转录因子-κB（NF-κB）表达改变的影响。再分别采用NF-κB抑制剂BAY 11-7082和IL-4加入HMGB1实验组，观察NLRP3炎症复合体各组分和NF-κB表达的改变。结果 HMGB1可以促进小胶质细胞NLRP3炎症复合体NLRP3中各个组分的合成和表达，且呈浓度依赖效应。HMGB1这种效应可以被NF-κB抑制剂BAY 11-7082所抑制，表现为与400 ng/mL HMGB1组比较，400 ng/mL HMGB1＋BAY组细胞NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白相对表达量均明显下降，差异均有统计学意义（P〈0.05）。而IL-4也能显著下调HMGB1诱导的NLRP3炎症复合体形成，表现为与400 ng/mL HMGB1组比较，400 ng/mL HMGB1＋IL-4组细胞NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白相对表达量均明显下降，差异均有统计学意义（P〈0.05）。进一步研究发现IL-4也可以同时抑制小胶质细胞NF-κB的活性。结论 HMGB1通过激活NF-κB促进小胶质细胞NLRP3炎症复合体的表达；IL-4通过负调控NF-κB活性抑制HMGB1介导的NLRP3炎症复合体形成。

当归多糖对慢性肾功能衰竭大鼠肾组织NLRP3炎症体信号通路的影响

目的探究当归多糖对慢性肾衰竭(CRF)大鼠肾组织NLRP3炎症体信号通路的影响。方法采用5/6肾切除法构建CRF模型,随机分为模型组、尿毒清(2.25 g·kg^(-1))组和当归多糖低(100 mg·kg^(-1))、中(200 mg·kg^(-1))、高(400 mg·kg^(-1))剂量组,另设置假手术组(大鼠开腹后不切除肾脏),观察大鼠肾功能变化,HE染色观察肾组织病理形态,比较各组大鼠肾功能、肾组织氧化应激指标和血清促炎因子水平变化,蛋白免疫印迹法检测大鼠肾组织NLRP3炎症体信号通路蛋白表达。结果模型组大鼠肾小管管壁薄厚不匀,呈萎缩或空泡样变性,肾小球囊腔扩张变大,系膜细胞明显增生,肾间质出现纤维化变性并伴有大量炎症细胞浸润;归多糖低、中、高剂量组及尿毒清组大鼠肾组织病理损伤均有改善,且当归多糖高剂量组与尿毒清组大鼠肾组织病理损伤改善程度最强。当归多糖可降低CRF大鼠血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、24 h尿蛋白含量,降低肾组织丙二醛(MDA)水平和血清白细胞介素(IL)-18、IL-1β、IL-6水平,降低肾组织Nod样受体家族含有pyrin结构域蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)、IL-1β蛋白表达,且呈剂量依赖性(P<0.05)。结论当归多糖可减轻CRF大鼠肾组织炎症、氧化应激水平,缓解肾组织损伤,改善肾功能,可能与抑制NLRP3炎症体信号激活有关。

NLRP3炎性复合体在抗感染免疫中的作用

NLRP3炎性复合体(inflammasome)在抗感染免疫和疾病发生过程中发挥着非常重要的作用。NLRP3炎性复合体能被多种激活剂所激活,对于其激活途径目前较公认的有三种:K+通道模型、溶酶体破坏模型和活性氧模型。现就NLRP3炎性复合体的组成、活化途径以及其进展做一简要介绍,并将其在抗感染免疫中的作用进行描述。