NLS-RARα通过激活AKT调节白血病NB4细胞的增殖

目的构建携带NLS-RARα的重组慢病毒,感染白血病NB4细胞并观察其对NB4细胞增殖和AKT蛋白的影响。方法以质粒p CMV-HA-NLS-RARα为模板,PCR扩增NLS-RARα基因,将其亚克隆到慢病毒表达载体质粒LV5中,经DNA测序鉴定重组载体,用4质粒系统共转染293T细胞,收集病毒上清,浓缩鉴定,测定重组慢病毒的滴度;重组慢病毒感染NB4细胞,经过嘌呤霉素筛选获得稳定转染NLS-RARα的NB4细胞株;CCK-8法检测NLSRARα对NB4细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞周期和感染效率;Western blot分别检测NLS-RARα、t-AKT和p-AKT的表达。结果 NLS-RARα克隆入LV5的多克隆位点,慢病毒浓缩后滴度为2×108Tu/m L;感染效率为86.54%;NLS-RARα能够明显促进细胞增殖,S期细胞增多,G1和G2期细胞减少;NLS-RARα基因在NB4细胞中稳定的表达,同时p-AKT明显增高,用PI3K抑制剂LY294002处理后p-AKT明显降低。结论 NLS-RARα通过激活AKT促进白血病NB4细胞的增殖。

NLS-RARα蛋白相互作用蛋白的筛选与验证(英文)

急性早幼粒细胞白血病(APL)具有特征性染色体易位,产生的PML-RARα融合基因在其发生发展中有重要作用.PML-RARα融合蛋白在细胞内被中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)切割为PML突变蛋白(核定位信号NLS缺失)和RARα突变体(NLS-RARα,包含有PML的核定位信号),这两段蛋白质在APL的发生中可能具有重要作用.为进一步研究NLS-RARα的生物学功能,运用酵母双杂交技术在白血病cDNA文库中筛选与其作用的蛋白质.首先PCR技术扩增NLS-RARα编码序列,克隆至诱饵载体pGBKT7,测序鉴定后将其转化酵母AH109.免疫印迹检测到诱饵蛋白表达后,将含有诱饵载体的AH109与含有白血病cDNA文库的酵母Y187交配,在含有X-α-gal的营养缺陷性培养基上选择和筛选二倍体酵母.经回转实验和测序分析验证得到8个与NLS-RARα相互作用的蛋白质.为进一步验证这些相互作用,克隆其中的JTV-1蛋白,利用间接免疫荧光,GSTpull-down和免疫共沉淀技术成功验证了它与NLS-RARα的相互作用.为进一步探讨APL的发生机制提供了新的线索.

NLS-RARα蛋白在重组腺病毒Ad-NE感染的NB4中定位的验证

该实验主要验证重组腺病毒Ad．NE感染NB4细胞后，NLS-RARa蛋白的表达及其定位。用重组腺病毒Ad-NE感染NB4细胞，检测感染效率，分别用RT-PCR和Westernblot法在mRNA水平和蛋白水平验证转染成功：提取转染成功的NB4细胞的核蛋白，Westernblot法检测细胞核中NLS—RARα蛋白的表达；FITC—AnnexinV／DAPI双染色免疫荧光法检测转染成功的NB4细胞NLS-RARα的表达及定位；FITC—AnnexinV／PI双染色激光共聚焦法检测转染成功的NB4细胞中PNLS-RARα的表达及定位。结果显示，重组腺病毒Ad—NE和阴性对照腺病毒Ad-KZ对NB4细胞的感染效率可达70％～80％。RT-PCR和Westernblot结果显示，感染了重组腺病毒Ad—NLS-RAR的NB4细胞成功表龇基因和NE蛋白，且有NLS．RARa的蛋白表达。用细胞免疫荧光法、激光共聚焦法检测出已感染的NB4细胞中NLS—RARer蛋白的表达，并推测其主要定位于胞核。综上所述，该文成功用重组腺病毒Ad-NE感染NB4细胞，并用Westernblot法、免疫荧光法、激光共聚焦法验证了NLS-RARα蛋白的存在并推测其定位，为进一步研究急性早幼粒细胞白血病的早期诊断及复发监测提供了新的思路。

NLS-RARα基因沉默对HL-60细胞增殖及分化的影响

目的探讨抑制NLS-RARα基因表达对急性早幼粒细胞白血病(Acute promyeolic leukemia,APL)细胞株HL-60增殖及分化的影响。方法将针对NLS-RARα基因的shRNA真核表达质粒(干扰组)和阴性对照质粒(阴性对照组)采用脂质体法转染HL-60细胞,并设未转染组,经G418筛选出稳定转染的细胞,采用MTT法检测细胞的增殖活力;RT-PCR和QRT-PCR法检测细胞中NLS-RARα基因mRNA的转录水平;Western blot法检测细胞中NLS-RARα蛋白的表达水平;流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD11b的表达及细胞周期的分布。结果与阴性对照组和未转染组比较,干扰组HL-60细胞的增殖活力、NLS-RARα基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均明显下降(P<0.05);CD11b的表达明显升高(P<0.05);G1、G2期细胞比例明显增加,S期细胞比例明显减少(P<0.05)。结论抑制NLS-RARα基因的表达可抑制HL-60细胞增殖,促进其分化。本实验为进一步研究APL发生发展的机制及APL的分子诊断和靶向治疗新途径奠定了基础。

Ad-NLS-RARα对HL-60细胞增殖及ATRA诱导的HL-60细胞分化的影响及其机制

目的将已构建验证成功的重组腺病毒Ad—NL＆RARα感染至HL-60细胞中，探讨其对HL-60细胞增殖及全反式维甲酸（ATRA）诱导的HL-60细胞分化的影响及机制。方法将验证正确的腺病毒经Protaminesulfate辅助感染Hl-60细胞，检测感染效率，用RT-PCR和Westernblot检测目的基因在HL-60细胞中的表达情况。MTT法检测细胞增殖情况。病毒感染HL-60细胞24h后，用2．5μmol／LATRA处理，流式细胞术（FCM）检测细胞表面分化抗原CDllb的表达。RT—PCR和Western blot检测GMYC基因在mRNA和蛋白水平的表达。结果在Protamine sulfate辅助感染作用下，重组腺病毒Ad—NLS-RARα和阴性对照腺病毒Ad—KZ对HL-60细胞的感染效率可达70％～80％。NL＆RARα基因的RT—PCR和Westernblot结果显示，感染了重组腺病毒Ad—NL＆RAR口的HL-60细胞的NLS-RAR口基因的mRNA及蛋白表达水平明显增高（P〈0．05）。MTT法检测表明感染了重组腺病毒Ad-NLS-RARα的细胞增殖能力增高（P〈O．05）。FCM检测结果显示，经ATRA处理后，感染Ad—NLS-RAR口重组腺病毒的HL-60细胞，CDllb表达较阴性对照组和未感染组下调（P〈O．05）。C-MYC基因的RT—PCR和Westernblot检测结果表明，经ATRA处理后，感染Ad—NLS-RARα重组腺病毒的细胞C—MYC基因的mRNA和蛋白水平均高于其他两组（P〈0．05）。结论重组腺病毒Ad—NL-SRARα可以促进HL-60细胞的增殖，并通过上调GMYC基因的表达，抑制ATRA诱导的HL-60细胞分化。

重组腺病毒Ad-NLS-RARα的构建及其在K562细胞中的表达

目的构建含NLS-RARα基因的重组腺病毒Ad-NLS-RARα,并检测其在K562细胞中的表达。方法以质粒pGBKT7-PML-RARα为模板,PCR扩增NLS-RARα基因,与穿梭质粒dTrace-TO4连接,构建重组穿梭质粒pAdTrack-TO4-NLS-RARα,经PmeⅠ酶切线性化后,转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态大肠埃希菌BJ5183,获得重组腺病毒质粒pAd-NLS-RARα,经PacⅠ酶切线性化后,转染AD293细胞,获得重组腺病毒Ad-NLS-RARα,经4轮扩增后,测定重组腺病毒滴度,并进行PCR及测序鉴定;将重组腺病毒感染K562细胞,采用流式细胞术测定感染效率,RT-PCR法和Western blot法检测NLS-RARα在K562细胞中的转录及表达水平。结果重组腺病毒Ad-NLS-RARα经4轮扩增后,滴度可达6.9×108pfu/ml,PCR及测序鉴定证明构建正确,对K562细胞的感染效率可达70%左右;重组腺病毒Ad-NLS-RARα携带的NLS-RARα基因可在K562细胞中高效表达。结论已成功构建了重组腺病毒Ad-NLS-RARα,并在K562细胞中高效表达了NLS-RARα基因。

NLS-RARα对人白血病细胞NB4分化抑制及其机制的研究

该文旨在探讨带核定位信号的维甲酸受体α(nuclear localization signal retinoic acid receptor alpha,NLS-RARα)对人急性早幼粒白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)细胞株NB4分化的影响及其机制。免疫印迹实验检测全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)诱导的NB4细胞分化标志物C/EBPβ、CD11b和p38α蛋白质水平;利用慢病毒介导的NLS-RARα基因过表达,进一步用免疫印迹实验验证过表达效率并检测NLS-RARα对NB4细胞分化标志物C/EBPβ、CD11b和p38α蛋白质水平的影响;间接免疫荧光实验分析NLS-RARα与p38α的空间共定位;免疫共沉淀实验分析NLS-RARα与p38α的相互作用。结果显示,生理浓度和药理浓度的ATRA促进NB4细胞分化的同时也激活了p38α,且p38α的活性变化与髓系分化标志物C/EBPβ变化一致;髓系分化表面标志物CD11b表达量在药理浓度ATRA(1μmol/L)处理下达到最高;NLS-RARα抑制NB4细胞的分化,且只有在ATRA存在的条件下,NLS-RARα抑制NB4细胞的分化与下调p38α活性相关;NLSRARα与p38α存在空间共定位且NLS-RARα与p38α直接相互作用。该研究结果提示,当存在ATRA诱导时,NLS-RARα与p38α直接相互作用后下调p38α的活性进而抑制NB4细胞的分化。

带核定位信号的RARα与JTV1蛋白相互作用的验证实验

目的通过实验验证带有核定位信号的维甲酸受体α(NLS-RARα)与JTV1蛋白之间的相互作用。方法将表达NLS-RARα诱饵蛋白和JTV1靶蛋白的两种重组表达质粒共转化AH109酵母菌,通过一对一的酵母双杂交技术验证两者在活细胞内的相互作用;构建NLS-RARα及JTV1蛋白标签融合表达载体并共转染人胚肾293细胞,利用免疫共沉淀技术在体外验证二者之间的相互作用。结果NLS-RARα诱饵蛋白和JTV1靶蛋白质粒共转化AH109酵母菌后,可见蓝色阳性克隆;NLS-RARα及JTV1蛋白标签融合表达载体构建成功,共转染293细胞,抗HA多克隆抗体沉淀HA-NLS-RARα相互作用蛋白复合物后,用抗Myc单克隆抗体进行免疫印迹检测,可以检测到Myc-JTV1蛋白。结论利用酵母双杂交和免疫共沉淀技术验证了NLS-RARα与JTV1间存在相互作用。

全反式维甲酸通过降解核定位信号-视黄酸受体α促进人白血病细胞分化

目的研究全反式维甲酸(ATRA)对核定位信号-视黄酸受体α(NLS-RARα)过表达细胞分化的作用。方法用慢病毒在NB4细胞和U937细胞过表达NLS-RARα蛋白,用实时定量PCR检测NLS-RARα、CD11b、CCAAT增强子结合蛋白β(CEBPβ)的mRNA水平,Westernblot法检测NLS-RARα、CD11b、CEBPβ蛋白水平;ATRA处理后,用Western blot法检测细胞CD11b蛋白水平以及ATRA对NLS-RARα蛋白的降解情况;用改良Wright染色法观察细胞分化形态。结果慢病毒感染的NB4细胞和U937细胞过表达NLS-RARα蛋白,过表达NLS-RARα可下调细胞CD11b、CEBPβ的表达水平;ATRA可以促进NLS-RARα过表达细胞的分化;ATRA可以降解NLS-RARα且呈时间浓度依赖性。结论ATRA通过降解NLS-RARα促进白血病细胞的分化。