听源性惊厥大鼠惊厥后NMDA受体NR1亚基蛋白表达和功能研究

目的 :探讨惊厥后大脑皮质N 甲基 D 门冬氨酸 (NMDA)受体亚基NR1蛋白表达及其功能改变与癫痫发病机制的关系。方法 :P77PMC大鼠按惊厥后不同时间随机分为 6组 ,免疫组化每组 6个样本 ,配基结合实验每组 5个样本 ,制备大脑冰冻切片和大脑皮质突触膜。利用免疫组化技术 ,观察听源性癫痫易感大鼠P77PMC惊厥后不同时间NR1亚基蛋白的表达 ,应用配基结合实验观察听源性惊厥大鼠P77PMC惊厥后大脑皮质突触膜对3H MK80 1的结合改变 ,以及NMDA受体激动剂对其结合的影响。结果 :大脑皮质在惊厥后 4hNR1蛋白表达即开始增加 ,2 4～48h达高峰。反应体系中无任何NMDA受体激动剂时 ,惊厥后大脑皮质突触膜对 3H MK80 1的结合有增加趋势 ,但差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ;当反应液中加入NMDA受体激动剂时 ,惊厥后大脑皮质突触膜对 3H MK80 1的结合明显增加 ,除惊厥后 4h与正常对照组比较差异无显著性外 ,其他惊厥后各时间点与正常对照组比较差异均有显著性(P <0 0 1)。结论 :听源性惊厥大鼠P77PMC惊厥后 ,大脑皮质NMDA受体NR1亚基蛋白表达增加 ,NMDA受体对其激动剂的敏感性增加 ,提示NR1亚基参与了P77PMC大鼠惊厥的发生与发展 ;

前脑缺血再灌流后大鼠海马NMDA受体亚单位NR2A和NR2B蛋白质表达的变化

用免疫组织化学和图像处理方法 ,观察分析了大鼠前脑缺血 15 min后再灌流 2 h～ 7d的海马结构各区域 NMDA受体亚单位 NR2 A和 NR2 B的表达变化规律及其差异 ,藉以探讨二者在缺血性脑损伤中的作用。结果显示 :( 1) NR2 A在 CA1 区和CA3 区的表达于再灌早期表现为小幅度下降 ( P<0 .0 5 ) ,此趋势在 CA3 区可以逆转 ;但在 CA1 区逐渐加剧 ,第 7d时降至 2 1% ,NR2 A在齿状回的表达几无改变 ;( 2 )与 NR2 A不同 ,再灌后 2 h,NR2 B在 CA1 区的表达即较对照组增高 ( P<0 .0 5 ) ,并持续到再灌后 2 4h,之后转而急剧下降 ,至第 7d仅余 11% ;在 CA3 区及齿状回 ,再灌后 6～ 48h,NR2 B的表达也较对照组增高 ( P<0 .0 5 ) ;在再灌后 72 h则恢复至对照组水平。结果提示 ,缺血性脑损伤后 NR2 A和 NR2 B表达变化的不同可能是造成 CA1 区。

缺氧对大鼠皮层、海马NMDA受体NR1亚单位磷酸化的影响

目的观察缺氧模型大鼠皮层、海马NMDA受体NR1亚单位酪氨酸磷酸化的变化。方法成年大鼠置于模拟海拔5500m高度的低压氧舱内,每天缺氧8h,分别缺氧3、7、14d和21d。采用免疫组化、Western blot+免疫共沉淀方法检测皮层、海马NR1及其酪氨酸磷酸化的变化。结果免疫组化显示缺氧皮层、海马NR1表达都明显高于对照组(P<0.01)。Western blot检测进一步证明NR1的表达显著高于对照组(P<0.01),且随着缺氧时间的延长而增加。缺氧各组酪氨酸磷酸化水平亦显著高于对照组(P<0.01),缺氧14d后酪氨酸磷酸化达到最高峰,而后开始下降,21d时仍显著高于对照组(P<0.01)。结论高原缺氧条件下大鼠皮层、海马NMDA受体NR1亚单位表达及酪氨酸磷酸化水平显著增加,酪氨酸磷酸化的变化可能是影响NMDA受体功能的主要原因。

参榆洗液对痔术后大鼠痛觉敏化及cAMP/PKA信号通路和TRPV1蛋白表达的影响

目的探讨参榆洗液对痔术后大鼠痛觉敏化及环磷酸腺苷/蛋白激酶A(cAMP/PKA)信号通路、香草酸瞬时受体亚型1(TRPV1)蛋白表达的影响。方法取40只雄性SD大鼠,随机选择其中8只作为空白组,其余大鼠采用冰醋酸建立痔术后创面模型。将造模成功大鼠随机分为模型组及参榆洗液低、中、高剂量组,每组8只。自成功造模后的第1天开始,模型组给予高压灭菌水局部熏洗,参榆洗液低、中、高剂量组分别予以参榆洗液0.4 g生药/mL、0.8 g生药/mL、1.6 g生药/mL局部熏洗,均2次/d,每次15 min,2次治疗间隔12 h,连续7 d。记录大鼠第1,4,7天换药刺激后3 min内首次舔舐肛周创面潜伏时间、扭体反应次数以及舔舐肛周创面总时间,观察造模后和干预3,5,7 d后创面情况并记录创面愈合率,HE染色观察干预7 d后创面组织病理学形态,Western blot法检测干预7 d后创面组织中cAMP、PKA蛋白和背根神经节中TRPV1、p-PKA蛋白表达情况。结果与空白组比较,模型组大鼠首次舔舐肛周创面潜伏时间明显缩短(P<0.05),扭体反应次数明显增加(P<0.05),舔舐肛周创面总时间明显延长(P<0.05);创面组织中有大量中性粒细胞与淋巴细胞浸润,组织水肿明显;创面组织中cAMP、PKA蛋白相对表达量及背根神经节中TRPV1、p-PKA蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05)。与模型组比较,参榆洗液中、高剂量组大鼠首次舔舐肛周创面潜伏时间明显延长(P均<0.05),扭体反应次数明显减少(P均<0.05),舔舐肛周创面总时间明显缩短(P均<0.05);参榆洗液各组干预5,7 d后创面愈合率更高(P均<0.05);参榆洗液各组大鼠创面组织中中性粒细胞、淋巴细胞浸润减少,成纤维细胞、新生血管增多;参榆洗液各组创面组织中cAMP、PKA蛋白相对表达量及背根神经节中TRPV1、p-PKA蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05),且呈剂量依赖性下降(P均<0.05)。结论参榆洗液可呈剂量依赖性改善痔术后大鼠痛觉敏化,促进创面愈合,机制可能与下调cAMP/PKA信号通路相关蛋白及TRPV1蛋白表达有关。

慢性复合应激对大鼠学习与记忆及海马NMDA受体NR1亚基表达的影响

目的 :观察慢性复合应激对大鼠学习与记忆的影响和海马内NMDA受体亚基NR1表达的变化。方法 :成年雄性Wistar大鼠实验组每天交替暴露于复合应激原环境中达 6w ,然后作Morris水迷宫和Y迷宫作业测试 ,再采用免疫组织化学和图像处理方法分析海马CA1、CA3和齿状回区内NR1的表达变化。结果 :慢性复合应激组大鼠寻找平台的潜伏期较对照组明显缩短 ,学会躲避电击的正确次数较对照组明显增多 ;海马内NMDA受体亚基NR1的表达水平较对照组明显上调。结论 :慢性复合应激可增强学习与记忆能力 。

成年新生神经元NMDA受体NR2B亚型基因条件性敲除模型建立

目的:建立成年神经发生中新生颗粒细胞N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体NR2B亚型基因条件性敲除模型。方法:运用逆转录病毒基因标记技术,结合Cre-1oxp重组酶系统,在ROSA26-LacZ基因报告小鼠体内研究逆转录病毒RSV-pGFP:T2aCre的Cre酶重组的发生以及其转化效率。在NR2Bfl/fl转基因小鼠中建立成年新生颗粒细胞NR2B基因敲除模型。结果:在逆转录病毒注射后14 d,观察到LacZ标记的神经元及β-gal和Cre免疫荧光双标阳性细胞,在海马齿状回颗粒下层、颗粒层以及hilus区表达;同时在嗅球颗粒层也可见LacZ表达。28 dCre转化效率高达98.3%。在NR2Bfl/fl转基因小鼠,14 d时分别在嗅球和齿状回的颗粒细胞层,观察到GFP和Cre同时标记的阳性新生颗粒细胞。结论:成年神经发生中起源于海马齿状回颗粒下层和侧脑室旁脑室管膜下区的新生颗粒细胞NR2B基因敲除模型建立。

NMDA受体亚基NR_1的体外表达及功能检测

目的 :体外表达NMDA受体亚基NR1并了解其电生理学特性 ,探讨体外表达受体亚基的意义。方法 :将克隆的NMDA受体亚基NR1质粒DNA经体外转录成RNA ,显微注射到爪蟾卵母细胞后进行受体表达 ,采用双电极电压钳位技术记录表达的NR1亚基的激活电流。结果 :注射NR1亚基RNA的爪蟾卵母细胞能表达出具有电生理学功能的受体 ,其激活电流能被D AP5阻断等特性 ,说明该表达的NR1亚基具有NMDA受体的功能。结论 :爪蟾卵母细胞表达的NR1亚基具有NMDA受体的生物学功能 。

NMDA受体NR2B亚型基因对海马成年新生神经元形态发生的影响

目的研究NMDA受体NR2B亚型基因对海马成年新生颗粒细胞形态发生的影响。方法通过Cre-loxp重组酶系统构建NMDA受体NR2B亚型基因单细胞敲除模型。运用Neurolucida软件系统对野生型、NR2B基因敲除成年新生神经元进行形态重建,观察树突长度、树突复杂度以及棘突的变化。结果 NR2B基因敲除成年新生神经元外形与WT神经元相似,树突长度接近,棘突减少。Sholl分析显示在以胞体为中心,距胞体不同距离的树突亚区域内,树突复杂性(树突交叉)减低,与此同时棘突分布密度减低(P<0.05)。结论海马成年新生颗粒神经元NR2B基因敲除对新生细胞树突长度影响甚微,但降低了树突复杂性,减少棘突形成,从而导致了功能性整合入海马特定神经信息网络的障碍。

儿童脓毒症患儿血清可溶性髓样细胞触发受体-1、可溶性CD14亚型、前降钙素和超敏C反应蛋白水平的变化

目的探讨儿童脓毒症患儿血清可溶性髓样细胞触发受体-1(sTREM-1)、可溶性CD14亚型(sCD14-ST)、前降钙素(PCT)和超敏C反应蛋白(hs-CRP)水平的变化。方法选取2015年1月~2018年8月儿科住院治疗儿童脓毒症患儿50例作为观察组,根据其病情程度分为严重脓毒症18例与非严重脓毒症32例。另选择同期在我院体检中心检查的正常健康儿童30例为对照组。比较对照组与观察组、严重脓毒症及非严重脓毒症血清sTREM-1、sCD14-ST、PCT和hs-CRP水平。结果观察组患儿血清sTREM-1、sCD14-ST、PCT和hs-CRP水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01);严重脓毒症患儿sTREM-1、sCD14-ST、PCT和hs-CRP水平明显高于非严重脓毒症患儿,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论血清sTREM-1、sCD14-ST、PCT和hs-CRP水平不仅可用于儿童脓毒症早期诊断,而且可评估患儿病情严重程度。

急性脑梗死患者血清死亡蛋白激酶1(DAPK1)与N-甲基-D-天门冬氨酸盐(NMDA)受体相关性的研究

目的联合应用抗血小板聚集(拜阿司匹林片)、和(或)抗凝(法安明)、和(或)降脂(辛伐他汀)和(或)溶栓(rt-PA)治疗急性脑梗死,同时观察血清死亡蛋白激酶1(death-associated protein kinase1,DAPK1)含量的变化,进一步探讨NMDA受体和死亡蛋白激酶(DAPK1)在脑梗死的相互作用,为缺血性脑血管疾病的防治提供临床依据。方法选择发病在72h以内住院急性脑梗死患者,分为溶栓组11例、常规治疗组56例,并选择我科因后循环缺血住院患者46例做为对照组。溶栓组除了给予rt-PA溶栓外,与常规治疗组均联合应用抗血小板聚集(阿司匹林肠溶片100mgqd)、和(或)抗凝(低分子肝素5000u皮下注射,每日2次)、和(或)降脂(辛伐他汀片20mgqN)及活血化瘀(奥扎格雷钠40mgqd)、清除自由基(依达拉奉30mg bid)等治疗,对照组仅给予常规的活血化瘀、营养神经等治疗,观察治疗前和治疗10d后患者的血清死亡蛋白激酶1(DAPK1)含量的变化,以及肝功能、血小板、凝血机制及临床神经功能缺损评分进行评定,进一步探讨NMDA受体和死亡蛋白激酶1(DAPK1)在缺血性脑血管疾病的相互作用机制。结果溶栓组及常规治疗组患者的死亡蛋白激酶1(DAPK1)含量均高于对照组,治疗10天后溶栓组及常规治疗组患者的死亡蛋白激酶1(DAPK1)含量均降低,常规治疗组更明显(P<0.05),溶栓组的神经功能缺损评分(NIHSS)明显降低(P<0.05),临床疗效明显优于常规治疗组(P<0.05),肝功能、血小板、凝血功能、血脂的指标均在正常范围内。结论死亡蛋白激酶1(DAPK1)通过与NMDA受体的NR2B亚型结合激活神经细胞死亡通路,激发神经细胞死亡,形成卒中[2],为缺血性脑血管病的防治提供临床依据。

异氟烷对老年大鼠认知功能及海马NMDA受体NR1亚基磷酸化的影响

目的探讨老年大鼠吸入异氟烷后其认知功能变化及NMDA受体NR1亚基磷酸化的分析。方法应用18月龄SD大鼠24只,雌雄各半,随机分成3组:0%异氟烷组(10%)、1.2%异氟烷组(11.2%)和1.8%异氟烷组(11.8%),n=8。对各组大鼠行Morris水迷宫测试,结束用western-blot检测磷酸化NMDA受体NR1亚基。结果11.2%组与10%组在第1天潜伏期比较有显著性差异(P<0.05),第2天以后各时间点潜伏期和空间探索实验的成绩与10%组同时间比较均无差异(P>0.05);11.8%组与10%组潜伏期和空间探索实验的成绩比较均有显著性差异(P<0.05)。11.8%组与10%组NMDA受体磷酸化NR1分析比较有显著性差异(P<0.05)。结论 1.8%异氟烷引起老年大鼠的认知功能下降,推测可能与海马NMDA受体NR1亚基磷酸化降低有关。

早期干预对未成熟大鼠脑损伤学习记忆及NMDA受体NR1亚单位表达的影响

目的探讨早期干预对未成熟大鼠脑损伤后学习记忆及NMDA受体NR1亚单位表达的影响。方法选2日龄SD大鼠制作未成熟大鼠脑损伤模型,随机分为丰富环境(EE)组、贫瘠环境(IE)组、标准环境(SE)组,每组20只。另选20只2日龄SD大鼠,仅分离左侧颈总动脉,不予结扎和缺氧,作为对照组(Sham)。EE组于术后第3天行触摸和丰富环境干预,总干预时间为30d。标准环境组和对照组均饲养于标准环境中,不行早期干预。干预结束后行学习记忆能力检测,同时分别于生后第7、35天取各组大鼠海马脑组织免疫细胞化学检测NR1亚单位表达。结果生后5周龄时,EE组学习记忆能力较SE组及IE组明显改善〔逃避潜伏期(ELP):4.75±2.85与12.45±3.23、8.42±2.23比较,空间探索能力:61.36±8.12与50.24±8.29、40.12±7.99比较,P<0.05〕;且丰富环境组海马CA1区NR1阳性反应物着色最强,与标准环境组、贫瘠环境组及对照组比较差异有统计学意义(43.2±6.6与59.5±8.1、88.5±15.5、62.3±9.5比较,P<0.01)。结论早期干预可增强未成熟大鼠脑损伤的学习记忆能力,NMDA受体NR1亚单位表达增多可能是其机制之一。

脑缺血再灌注大鼠皮质NMDA受体亚单位NR2A/B蛋白的表达变化

目的采用免疫细胞化学技术,探讨急性脑缺血再灌注不同时间段大鼠脑顶皮质NMDA受体亚单位NR2A及NR2B蛋白的表达变化。方法雄性Wistar大鼠70只,随机分成正常对照组、假手术对照组、脑缺血再灌注对照组;以颈动脉引流法行全脑缺血7min再灌注造模。术后分6h、24h、72h3个时间段取脑,脑组织恒冷箱连续冠状切片,免疫细胞化学ABC反应,图像分析系统行顶皮质Ⅰ区Ⅴ层免疫阳性面积检测。结果(1)麻醉及假手术可导致顶皮质NR2A、NR2B蛋白表达短暂增多,24h内恢复正常;(2)缺血再灌注后6h前后形成表达高峰,24h恢复正常,随后表达急剧减少,持续至72h以后。结论(1)脑缺血再灌注可导致顶皮质神经元NR2A、NR2B蛋白表达变化,且表达存在明显的时间依赖性;(2)缺血再灌注早期皮质NR2A、NR2B蛋白高度表达可能是导致迟发性神经元丢失的重要原因。

NMDA谷氨酸受体NR1亚基在大鼠前庭终器的表达

目的研究NMDA谷氨酸受体NR1亚基在大鼠前庭终器的表达。方法运用RT-PCR技术检测大鼠前庭终器NR1亚基的基因表达。以大鼠脑组织RNA为阳性对照。结果在前庭终器中扩增出标志NMDA谷氨酸受体NR1亚基基因表达的PCR产物,并经测序证实与预计扩增的cDNA片断序列一致。结论NMDA谷氨酸受体NR1亚基在大鼠前庭终器有表达,为谷氨酸作为前庭重要的神经递质之一提供了证据。NMDA谷氨酸受体可能作为自身受体在前庭系统神经信息传递过程中起到正反馈调节作用。

NMDA受体2B亚型（NR2B）在疼痛治疗中的价值

NR2是谷氨酸NMDA受体2型受体（NR2）的亚型。近年来研究发现其与疼痛的中枢敏化密切相关。选择性NR2B拮抗剂在动物模型具有较好的镇痛作用，同时没有常规NMDA受体所具有的中枢副作用。临床试验发现患者对其有很好的耐受性，但需要验证在疼痛患者中的镇痛效能。

蛋白激酶Cγ亚型和N-甲基-天门冬氨酸受体1在硝酸甘油致偏头痛大鼠模型发病机制中的作用探讨

目的通过硝酸甘油致偏头痛大鼠模型,初步探讨蛋白激酶Cγ亚型(PKCγ)、N-甲基-天门冬氨酸受体1(NMDAR1)和磷酸化NMDAR1在偏头痛发病机制中的作用。方法将30只成年雌性SD大鼠随机分为对照组、模型组、干预组,后两组再各自分为发作期组和间歇期组,每组6只。模型组及干预组按Tassorelli Cristina法复制偏头痛大鼠模型,对照组用生理盐水造模。干预组每天灌服氟桂利嗪2 ml(0.5 mg/kg),对照组每天灌服生理盐水2 ml。受试动物于第5次造模后2 h(发作期组)或第4天(对照组及间歇期组)分别断头处死取脑干组织。RT-PCR法检测PKCγ及NMDAR1 mRNA,Western-Blot检测PKCγ、NMDAR1、磷酸化NMDAR1蛋白的表达。结果与对照组相比,无论是偏头痛发作期组和间歇期组,还是模型组和干预组大鼠脑干组织中PKCγ、NMDAR1 mRNA及蛋白的表达差异均无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,模型组PKCγ依赖的磷酸化NMDAR1蛋白的表达明显上调(P<0.05);干预组也稍有上调,但差异无统计学意义(P>0.05)。模型组与干预组,以及发作期与间歇期相比,磷酸化NMDAR1蛋白的表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论偏头痛的发生发展可能与PKCγ依赖的磷酸化NMDAR1蛋白表达的上调有关,可能与PKCγmRNA及蛋白、NMDAR1 mRNA及蛋白(非磷酸化)的表达量无关。氟桂利嗪预防偏头痛发作的机制之一可能是打断了PKCNMDAR这一正反馈环路的恶性循环。

甲基苯丙胺与HIV-Tat蛋白协同致大鼠纹状体NMDA受体NR2B亚基和iNOS的表达

目的观察甲基苯丙胺(MA)与HIV-Tat蛋白协同作用致大鼠相关脑区N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体NR2B亚基和诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)的表达变化,探讨MA与HIV-Tat协同作用对神经系统的影响.方法 50只健康雄性SD大鼠随机分为实验组:MA组(10 mg/kg MA,每日2次腹腔注射,连续4 d)、HIV-Tat组(10μg HIV-Tat注入大鼠脑纹状体)和MA+HIV-Tat组(按MA组注射MA 4 d后按HIV-Tat组注入HIV-Tat);对照组:生理盐水腹腔注射或纹状体内注射.各组大鼠分别于注射结束后48 h和7 d处死,麻醉后用多聚甲醛灌注,取出脑组织并固定,石蜡包埋,作冠状切面,用免疫组化和蛋白免疫印迹法对中毒大鼠纹状体中NMDA受体NR2B亚基和iNOS的表达进行观察,并进行图像分析,测量其平均光密度值,与对照组比较并进行统计学分析.结果各实验组与对照组比较,纹状体内NMDA受体NR2B亚基和iNOS的表达均有不同程度增高,差异具有统计学意义(P<0.05);其中MA+HIV-Tat组与MA组、HIV-Tat组比较,NMDA受体NR2B亚基和iNOS的表达显著增高(P<0.05).结论 MA与HIV-Tat蛋白的共同作用能够显著增加NMDA受体NR2B亚基和iNOS的表达,揭示NMDA受体NR2B亚基和iNOS参与了MA与HIV-Tat蛋白的协同神经毒性机制.

雌激素受体α、雌激素受体β、激活蛋白1、血管内皮生长因子在大鼠子宫内膜异位症模型中的表达及意义

目的探讨雌激素受体α(ERα)、雌激素受体β(ERβ)、激活蛋白1(AP-1)、血管内皮生长因子(VEGF)在大鼠子宫内膜异位症(EMs)模型中的表达及意义。方法采用皮下种植法建立大鼠EMs模型,选取建模成功的28只大鼠为模型组(n=28),观察大鼠EMs模型在位内膜及异位病灶的组织病理学改变,并通过免疫组织化学法检测对照组子宫内膜、模型组在位子宫内膜和异位病灶ERα、ERβ、AP-1、VEGF的表达情况。结果 1大鼠EMs模型在位内膜及异位病灶腺体、间质血管明显增加;2大鼠EMs模型的异位病灶与对照组子宫内膜间ERα阳性率比较,差异无统计学意义(P=0.107),而其在位内膜中的表达较对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。ERβ、AP-1(c-jun)蛋白、VEGF在模型组在位内膜及异位病灶中阳性率与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),但其在位内膜及异位病灶中的表达比较,差异无统计学意义。结论大鼠EMs模型在位内膜中ERα和ERβ均高表达,异位病灶中则仅表现为ERβ高表达,同时上调c-jun,VEGF的表达,ERβ可能在EMs的发生发展中起到较ERα更为重要的作用。

NMDA受体NR2B基因对海马成年新生神经元生存的影响

目的:研究NMDA受体NR2B基因对海马成年新生神经元生存的影响。方法:通过Cre-loxp重组酶系统构建NMDA受体NR2B亚型基因单细胞敲除模型。观察NR2B基因敲除神经元的存活情况及其形态发生。结果:在逆转录病毒注射后7、17、28、56 d,NR2Bfl/fl小鼠中,成年海马新生神经元生存比例在各观察时间点一致,与同组野生型神经元无显著性差异。NR2B基因敲除神经元神经元大体形态分化发育与野生型神经元类似,但在17、28 d时顶端树突上的棘突发生显著减少(P<0.01)。结论:NMDA受体NR2B亚型基因敲除对海马成年新生神经元生存无显著性影响,但可影响突触发生。