NMNAT1基因慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶-1(NMNAT1)基因慢病毒载体,为其体内外实验研究提供依据.方法:将靶向NMNAT1基因连接到慢病毒载体pGC-E3/Lenti中,获得pGC-E3-NMNAT1统一质粒,经PCR检测以及测序鉴定后,与慢病毒包装质粒通过LipofectamineTM2000共转染至包装细胞293T,包装产生病毒液,并测定其滴度.结果:PCR扩增和测序结果证实,Nmnat1核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液的滴度为1×105U/L.结论:成功构建NMNAT1基因慢病毒载体,为研究其在面神经损伤修复中的功能和基因治疗奠定了基础.

NMNAT1基因对体外原代培养神经元树突发育的影响

目的评价NMNAT1基因对原代培养小鼠神经元树突发育的影响。方法我们在体外建立了原代培养小鼠神经元模型,并通过RNA干扰和基因过表达的方法控制NMNAT1基因的表达水平。应用电穿孔转染,我们上调或下调NMNAT1基因的表达水平,应用免疫细胞化学方法研究神经元树突的形态。在所有的功能试验中,把FK-866(CAS658084-64-1)一种高效的特定的非竞争性NMNAT1抑制剂用作药物学对照。结果在体外原代培养的皮层神经元中下调NMNAT1基因能减缓树突生长和减少树突的数目。结论 NMNAT1基因在原代培养的皮层神经元形态发生中起显著作用,表明NMNAT1基因的丢失可能会引起中枢神经系统神经元变性。

小鼠NMNAT1基因的过表达和RNAi重组慢病毒的构建包装和检测

目的:针对小鼠烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1(NMNAT1)基因构建质粒并进行慢病毒包装,同时检测其表达水平和干扰效率,为进一步探讨该基因的功能提供研究工具和实验基础。方法:根据NMNAT1基因信息,用慢病毒载体pLenti6构建三种重组质粒,分别包含NMNAT1 cDNA全长、一个针对NMNAT1的小干扰序列和一个用于干扰对照的阴性序列。把这些质粒包装进慢病毒载体,并检测病毒滴度,再用慢病毒感染Hela细胞检测NMNAT1表达量和RNA干扰效率。结果:测序结果证明目的序列正确地插入到载体内。通过qPCR方法鉴定慢病毒包装成功,病毒滴度均为2×108 TU/ml以上。表达NMNAT1的重组慢病毒感染Hela细胞,该细胞能够高水平表达NMNAT1蛋白,而携带RNAi序列的慢病毒能够显著抑制其表达,干扰效率在70%以上。结论:针对NMNAT1的过表达和RNAi重组慢病毒制备成功,为进一步研究NMNAT1基因的功能和用慢病毒进行基因治疗提供了良好的研究工具。

高通量筛选NMNAT1抑制剂及其肿瘤杀伤作用

目的利用在大肠杆菌体系中诱导表达的人源NMNAT1蛋白筛选其抑制剂,寻找治疗肿瘤的新药物。方法利用酶切连接体系将人源NMNAT1插入pET21b(+)载体,将重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株过表达蛋白,对重组蛋白进行纯化,通过3段式酶联荧光法在2280种天然化合物中筛选具有抑制NMNAT1活性的化合物,并在细胞水平验证其对肿瘤细胞的杀伤效果。结果纯化得到较高纯度和活性的人重组NMNAT1蛋白;筛选出6种高效的NMNAT1抑制剂;其中一种抑制剂fraxetin能降低乳腺癌细胞NAD+含量,促进细胞凋亡,与敲低NMNAT1后转录组测序(RNA-seq)分析得出的细胞凋亡通路增强一致。结论Fraxetin是NMNAT1强效抑制剂,能够促进乳腺癌细胞凋亡。

利用目标区域捕获测序筛查Leber先天性黑噱的致病基因及其临床表型

目的探讨我国一个散发的Leber先天性黑嚎（LCA）家系的致病基因变异位点及其临床表型。方法实验研究。收集嘉兴市妇幼保健院一个散发LCA家系共7名家庭成员的临床资料，其中1名LCA患者，6名正常家属。完善该家系内所有成员的眼科检查，采集该家系成员的外周静脉血，提取基因组DNA，运用目标区域捕获测序技术来筛查患者的283个视网膜疾病相关的基因，测序结果运用生物信息学分析得到候选基因，最后用Sanger测序验证。结果临床检查结果表明患者呈现典型的LCA临床症状。遗传学筛查结果证实患者在NMNAT1基因上存在2个复合杂合变异和1个纯合变异：具体为杂合的错义变异（13．634C〉A，p．V212M），杂合的内含子变异（c．-57＋7T〉G）和纯合的错义变异（c．764G〉A，p．S255N）。结论本例患者的NMNAT1基因上存在3个不同的变异，很可能是导致其患有Leber先天性黑嚎的原因。

Leber先天性黑蒙症分子机制研究新进展及未来展望

Leber 先天性黑蒙症是一种严重的遗传性视网膜病变,常在婴幼儿时期发病,并伴有糖尿病、肥胖和尿崩症等一系列并发症,目前尚无特效药可以治疗.之前的一系列研究发现,有17个基因和Leber先天性黑蒙症相关.但是这17个基因仅能解释70%左右的先天性黑蒙症的发病机制,本实验室(Ming Qi实验组)及其他三个实验组(Jean-Michel Rozet实验组、Eric A Pierce实验组、Rui Chen实验组)最新发表在Nat Genet上的4篇论文揭示出NMNAT1基因也是Leber先天性黑蒙症的致病基因.这一发现解释了部分Leber先天性黑蒙症的遗传学机制,也为后期Leber先天性黑蒙症的诊断和基因治疗提供了理论依据.