长链非编码RNA NNT-AS1在肺炎患儿血清中的表达及其对脂多糖诱导的肺上皮细胞损伤的影响

目的 探究长链非编码RNA(lncRNA) NNT-AS1在肺炎患儿血清中的表达及其对脂多糖(LPS)诱导的肺上皮细胞损伤的影响。方法 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测NNT-AS1相对表达水平。将肺泡上皮细胞BEAS-2B分为对照组、LPS组(1 mg/L的LPS处理细胞)、LPS+si-NC组(转染si-NC,LPS处理细胞)、LPS+si-NNT-AS1组(转染si-NNTAS1,LPS处理细胞)、LPS+si-NNT-AS1+SB203580组(转染si-NNT-AS1,LPS处理和MAPK信号通路抑制剂SB203580细胞)。qRT-PCR检测NNT-AS1相对表达水平,流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白质印迹法(Western blot)检测cleaved-caspase3、Bax、p-ERK1/2、p-p38 MAPK蛋白表达,ELISA检测IL-6、IL-1β、TNF-α。结果 NNT-AS1在肺炎患儿血清中的相对表达水平高于健康对照。与对照组相比,LPS组中NNT-AS1相对表达水平、凋亡率、cleaved-caspase3、Bax、p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白表达水平明显增加,IL-6、IL-1β、TNF-α增多。与LPS+si-NC组相比,LPS+si-NNT-AS1组NNT-AS1相对表达水平、凋亡率、cleaved-caspase3、Bax、p-ERK1/2、p-p38 MAPK蛋白表达水平明显降低,IL-6、IL-1β、TNF-α减少。与LPS+si-NNT-AS1组相比,LPS+si-NNT-AS1+SB203580组凋亡率、cleaved-caspase3、Bax蛋白表达水平明显降低,IL-6、IL-1β、TNF-α含量减少。结论 沉默NNT-AS1可能通过抑制MAPK信号通路减轻LPS诱导的肺泡上皮凋亡和炎症反应。

lncRNA NNT-AS1对膀胱癌细胞增殖、转移及肿瘤干细胞干性的影响与机制研究

目的探究长链非编码RNA(lncRNA)NNT-AS1对膀胱癌细胞增殖、转移及肿瘤干细胞干性的影响和机制。方法qRT-PCR检测lncRNA NNT-AS1在膀胱癌细胞T24、5637、UM-UC-3、TCC-SUP和膀胱上皮细胞SV-HUC-1中的表达,将T24细胞和膀胱癌干细胞分为sh-NC组(转染sh-NC)、sh-NNT-AS1组(转染sh-NNT-AS1)、Control组(共转染sh-NC、inh-NC和si-NC)、sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC组(共转染sh-NNT-AS1、inh-NC和si-NC)、sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC组(共转染sh-NNT-AS1、miR-582-5p抑制物和si-NC)、sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1组(共转染sh-NNT-AS1、miR-582-5p抑制物和NCKAP1小干扰RNA)。CCK8检测各组细胞增殖能力;Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力;细胞成球实验检测各组干细胞干性;流式细胞术检测CD133和CD44表达;双荧光素酶报告基因实验检测lncRNA NNT-AS1与miR-582-5p及miR-582-5p与NCKAP1的靶向关系;体内成瘤实验检测lncRNA NNT-AS1对体内成瘤的影响;Western blot检测NCKAP1、YAP、TAZ、CD44、ALDH1A1、Oct4、Nanog蛋白表达。结果lncRNA NNT-AS1高表达于T24、5637、UM-UC-3、TCC-SUP细胞。与sh-NC组比较,sh-NNT-AS1组T24细胞增殖、迁移和侵袭能力显著下降(P<0.05),膀胱癌干细胞成球数、CD44、ALDH1A1、Oct4、Nanog蛋白表达及CD133^(+)CD44^(+)细胞比例显著减少(P<0.05)。lncRNA NNT-AS1调控miR-582-5p/NCKAP1分子轴。与Control组比较,sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC组细胞光密度(OD)值显著降低(P<0.05),细胞迁移和侵袭数显著减少(P<0.05),膀胱癌干细胞干性显著降低(P<0.05),肿瘤体积显著减小(P<0.05),YAP和TAZ表达显著下调(P<0.05)。与sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC组比较,sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC组细胞OD值、细胞迁移数和侵袭数均显著升高/增加(P<0.05),膀胱癌干细胞干性、肿瘤体积显著增加(P<0.05),YAP和TAZ表达均显著升高(P<0.05)。与sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC组比较,sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1组细胞OD值、细胞迁移数和侵袭数均显著降低/减少(P<0.05),膀胱癌干细胞干性、肿瘤体积显著减小(P<0.05),YAP和TAZ表达均显著降低(P<0.05)。结论lncRNA NNT-AS1通过调控miR-582-5p/NCKAP1分子轴影响膀胱癌细胞的增殖、转移及肿瘤干细胞干性,并激活Hippo-YAP/TAZ信号通路。

LncRNANNT-AS1通过调控miR-582-5p/NCKAP1轴激活Hippo-YAP/TAZ信号通路促进膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭和干细胞干性影响

目的检测膀胱癌中长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)烟酰胺核苷酸转氢酶反义RNA1(nicotinamide nucleotide transhydrogenase antisense RNA 1,NNT-AS1)表达情况,研究其对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭及肿瘤干细胞干性的影响及可能分子机制。方法实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)法检测膀胱癌组织标本及细胞中LncRNA NNT-AS1表达情况;将膀胱癌细胞转染分为sh-NC组,sh-NNT-AS1组,sh-NNT-AS1+inh-582-5p组和sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1组。采用CCK-8法检测细胞增殖吸光度值(A值);Transwell实验检测细胞迁移、侵袭穿膜数;细胞成球实验检测干细胞干性。检索starBase和TargetScan数据库,并通过双荧光素酶报告基因实验预测验证LncRNA NNT-AS1和miR-582-5p,miR-582-5p与NCKAP1的靶向结合关系。Western blot检测膀胱癌干细胞标志蛋白(CD44,ALDH1A1,Oct4,Nanog)及Hippo-YAP/TAZ信号通路相关蛋白表达灰度值。结果与癌旁组织相比,膀胱癌组织中LncRNA NNT-AS1表达水平(0.34±0.07 vs 1.15±0.21)明显升高,差异有统计学意义(t=16.364,P<0.001)。与人正常膀胱上皮SV-HUC-1细胞(1.00±0.01)相比,膀胱癌细胞T24,5637,UM-UC-3和TCC-SUP中LncRNA NNT-AS1表达(6.03±0.17,4.66±0.36,5.47±0.26,3.02±0.20)明显升高,差异有统计学意义(t=17.472~51.160,均P<0.001)。与sh-NC组相比,在24,48和72 h时sh-NNT-AS1组细胞增值能力(A值)均显著降低(0.80±0.01 vs 1.07±0.06,1.18±0..07 vs 1.83±0.03,1.89±0.07 vs 2.53±0.06),差异有统计学意义(t=7.688,14.783,12.024,均P<0.05);sh-NNT-AS1组细胞迁移穿膜数(55.00±2.65个vs 354.30±7.84个)、细胞侵袭穿膜数(45.67±2.33个vs 303.00±9.07个)及膀胱癌干细胞成球数(20.85±2.17个vs 41.35±3.67个)显著降低,差异具有统计学意义(t=-62.641,-47.596,8.328,均P<0.001)。与sh-NC组相比,sh-NNT-AS1组细胞中CD44(0.04±0.01 vs 1.12±0.02),ALDH1A1(0.23±0.01 vs 1.16±0.05),Oct4(0.17±0.02 vs 1.10±0.04),Nanog(0.49±0.03 vs 1.24±0.03)的蛋白表达灰度值显著降低,差异具有统计学意义(t=83.656,31.591,36.019,30.619,均P<0.001)。与si-NC组相比,sh-NNT-AS1组CD44+CD133+细胞比例(9.30%±0.79%vs 88.50%±2.77%)明显降低,差异有统计学意义(t=-47.624,P<0.001)。双荧光素酶报告基因检测结果显示miR-582-5p为LncRNANNT-AS1靶基因,NCKAP1为miR-582-5p靶基因;LncRNA NNT-AS1靶向调控miR-582-5p/NCKAP1轴。与sh-NNT-AS1组相比,在24,48,72 h时sh-NNT-AS1+inh-582-5p组细胞增值能力(A值)均明显升高(0.98±0.03 vs 0.73±0.06,1.74±0.04 vs 1.22±0.05,2.33±0.16 vs 1.69±0.14),差异有统计学意义(t=5.977~11.628,均P<0.001)。与sh-NNT-AS1+inh-582-5p组相比,在24,48,72 h时sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1组细胞增值能力(A值)显著降低(0.69±0.04,1.01±0.07,1.39±0.08),差异有统计学意义(t=7.877~16.323,均P<0.001)。与sh-NNT-AS1组相比,sh-NNT-AS1+inh-582-5p组细胞迁移穿膜数(322.31±28.45个vs 81.42±13.22个)、细胞侵袭穿膜数(316.07±30.21个vs 92.13±12.65个)及膀胱癌干细胞成球数(38.55±2.20个vs 18.98±1.16个)显著增加,差异具有统计学意义(t=15.115,13.158,14.592,均P<0.001)。与sh-NNT-AS1组相比,sh-NNT-AS1+inh-582-5p组细胞CD44(1.05±0.08 vs 0.10±0.01),ALDH1A1(1.20±0.16 vs 0.22±0.02),Oct4(1.32±0.14 vs 0.19±0.03),Nanog(0.97±0.12 vs 0.15±0.04),YAP(1.29±0.11 vs 0.42±0.07)和TAZ(1.41±0.16 vs 0.35±0.05)蛋白表达灰度值均显著增加,差异具有统计学意义(t=10.650~21.243,均P<0.001)。与sh-NNT-AS1+inh-582-5p组相比,sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1组细胞迁移穿膜数(65.33±12.60个)、细胞侵袭穿膜数(71.08±15.19个)、膀胱癌干细胞成球数(11.36±1.05个)均显著降低,差异具有统计学意义(t=16.125,14.395,21.365,均P<0.001)。与sh-NNT-AS1+inh-582-5p组相比,sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1组细胞CD44(0.25±0.05),ALDH1A1(0.61±0.11),Oct4(0.22±0.08),Nanog(0.44±0.07),YAP(0.25±0.09)和TAZ(0.30±0.04)蛋白表达灰度值显著降低,差异具有统计学意义(t=6.412~17.889,均P<0.001)。结论膀胱癌中LncRNA NNT-AS1表达上调,其对膀胱癌细胞增殖、侵袭及肿瘤干细胞干性的影响,可能是通过调控miR-582-5p/NCKAP1分子轴,激活Hippo-YAP/TAZ信号通路完成。

LncRNA NNT-AS1通过靶向miR-496调控卵巢癌细胞增殖、迁移及侵袭的分子机制

目的探讨长链非编码RNA NNT-AS1(LncRNA NNT-AS1)靶向微小核糖核酸(miR)-496抑制卵巢癌细胞增殖、迁移及侵袭的分子机制。方法实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测LncRNA NNT-AS1与miR-496在卵巢癌细胞及正常卵巢上皮细胞中的表达;双荧光素酶报告基因检测LncRNA NNT-AS1与miR-496之间的相互作用。MTT实验检测抑制LncRNA NNT-AS1及miR-496过表达后卵巢癌细胞增殖能力;Transwell迁移及侵袭实验检测抑制LncRNA NNT-AS1及miR-496过表达后卵巢癌细胞迁移及侵袭能力变化情况。qRT-PCR检测LncRNA NNT-AS1与miR-496之间的调控关系。结果与正常卵巢上皮细胞相比,LncRNA NNT-AS1在卵巢癌细胞中表达显著上调,miR-496表达水平显著下调;双荧光素酶实验证实LncRNA NNT-AS1可miR-496特异性结合并可调控miR-496表达;抑制LncRNA NNT-AS1表达与miR-496过表达后均可抑制卵巢癌细胞增殖、迁移及侵袭;抑制miR-496表达可逆转抑制NNT-AS1表达对卵巢癌细胞增殖、迁移侵袭的作用。结论LncRNA NNT-AS1可通过靶向调控miR-496表达进而促进卵巢癌细胞增殖、迁移及侵袭。

LncRNA NNT-AS1对胃癌细胞增殖、凋亡作用机制研究

目的探讨LncRNA NNT-AS1对胃癌细胞增殖、凋亡的作用机制。方法采用实时荧光定量PCR法检测胃癌细胞系KATO-III、NUGC-3、AGS、N87及正常胃成纤维细胞系NSFC中LncRNA NNT-AS1的表达水平;将KATO-III细胞系分成对照组、sh-vector组及sh-NNT-AS1组,分别不感染慢病毒、感染阴性shRNA慢病毒及感染lenti-sh-NNT-AS1慢病毒。采用MTT实验检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blot检测细胞凋亡蛋白Caspase 3、8、9的表达水平,并进行组间比较。结果胃癌细胞系KATO-III、NUGC-3、AGS、N87 LncRNA NNT-AS1的表达水平均明显高于正常胃成纤维细胞系NSFC(均P<0.01)。细胞培养12、24、48、72 h后,相比sh-vector组、对照组,sh-NNT-AS1组吸光度值(OD490值)明显降低(均P<0.05)。细胞培养7d后,sh-NNT-AS1组克隆形成数明显低于sh-vector组、对照组(均P<0.05)。sh-NNT-AS1组细胞凋亡率明显高于sh-vector组、对照组(均P<0.01)。sh-NNT-AS1组细胞凋亡蛋白Caspase3、9表达水平均高于sh-vector组(均P<0.05),而Caspase8表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 LncRNA NNT-AS1促进胃癌细胞增殖,抑制凋亡,机制可能与上调凋亡蛋白Caspase3、9表达有关。

姜黄素通过长链非编码RNA NNT-AS1降低LPS诱导的支气管上皮细胞炎症因子表达

目的探究姜黄素(curcumin)对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的人支气管上皮细胞炎症损伤的作用。方法收集慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmoriary disease, COPD)患者(n=30)和健康人(n=30)血液样本,分离血清,ELISA法检测血清中白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的含量;培养人支气管上皮细胞BEAS-2B,并将细胞分成3组:空白对照组、LPS处理组(10μg/mL)、LPS+Curcumin(5μmol/L)处理组,ELISA检测细胞上清中炎症细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β的含量,CCK-8法和EdU实验检测各组细胞增殖能力,实时定量PCR(qRT-PCR)和Western blot分别检测各组细胞lncRNA NNT-AS1和NF-κB信号通路相关因子NF-κB p65、IκBα的表达。结果 COPD患者血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β含量显著升高(均P<0.01);LPS处理显著增强BEAS-2B细胞增殖能力(P<0.01);LPS处理组细胞上清中的炎症细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β含量显著升高(均P<0.01);同时,LPS组细胞中lncRNA NNT-AS1和NF-κB p65的表达显著升高(均P<0.01),IκBα的表达水平显著降低(P<0.01);而上述的这些变化在姜黄素处理后均得到显著缓解。结论姜黄素能够通过调节lncRNA NNT-AS1/NF-κB信号通路缓解LPS诱导的支气管上皮细胞增殖和炎症因子的合成释放。

lncRNA NNT-AS1对卵巢癌细胞增殖、凋亡和侵袭的作用

目的研究卵巢癌细胞中NNT-AS1的表达情况,探索NNT-AS1沉默后对卵巢癌细胞增殖、凋亡及转移的影响。方法使用qRT-PCR检测卵巢癌HO-8910、SK-OV-3细胞的NNT-AS1表达情况。随后将卵巢癌HO-8910、SK-OV-3细胞分别分为siNNT-AS1组(NNT-AS1沉默组)、siNC组(阴性对照组)和control组(对照组),siNNT-AS1组和siNC组分别转染NNT-AS1沉默质粒siNNT-AS1和阴性对照质粒siNC,control组给予空载体。72 h后采用MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞侵袭能力,并采用比色法检测caspase-3、caspase-9活力。结果卵巢癌HO-8910、SK-OV-3细胞中NNT-AS1表达均低于正常卵巢细胞T29,差异有统计学意义(P<0.05)。与siNC组及control组HO-8910细胞系、SK-OV-3细胞系相比,siNNT-AS1组24,48,72 h的细胞增殖活性均增高(均P<0.05),细胞凋亡率均下降(均P<0.05),细胞侵袭能力均升高(均P<0.05),caspase-3、caspase-9活性均降低(均P<0.05)。结论NNT-AS1在人卵巢癌HO-8910、SK-OV-3细胞中表达降低,NNT-AS1表达下降可能与卵巢癌细胞的增殖和侵袭增加及凋亡下降有关;NNT-AS1可能通过抑制内源性途径进而调控卵巢癌细胞凋亡。

难治性支原体肺炎患儿血清LncRNA NNT-AS1、IL-17A水平变化及临床意义

目的 探讨血清LncRNA NNT-AS1、白细胞介素(IL)17A在难治性肺炎支原体肺炎(RMPP)患儿中的表达及临床应用价值。方法 选取2021年2月—2022年3月张家口市妇幼保健院诊治的148例MPP患儿(MPP组),根据是否发生RMPP分为RMPP组(48例)和非RMPP组(100例),以同期60例择期行鞘膜积液手术的患儿为对照组。比较各组血清LncRNA NNT-AS1、IL-17A的差异。采用Pearson相关分析研究血清LncRNA NNT-AS1、IL-17A与炎性指标的相关性。采用多因素logistic回归分析研究影响RMPP发病的因素。采用受试者工作特征曲线分析LncRNA NNT-AS1、IL-17A对RMPP发病的预测价值。结果 MPP组血清LncRNA NNT-AS1、IL-17A均高于对照组(P<0.05)。MPP组血清LncRNA NNT-AS1、IL-17A与CRP、PCT、IL-6、TNF-α均呈正相关关系(r=0.623~0.721,P<0.001)。血清LncRNA NNT-AS1、IL-17A升高是影响RMPP发病的独立危险因素。两者联合对MPP患儿发生RMPP的曲线下面积为0.906,优于单独检测。结论 RMPP患儿血清LncRNA NNT-AS1、IL-17A水平升高,是影响RMPP发病的独立危险因素,两者联合检测有助于评估RMPP的发生。

子宫内膜癌患者组织中lncRNA NNT-AS1、miR-22-3p表达水平及相关性分析

目的 探讨长链非编码RNA(lncRNA)烟酰胺核苷酸转氢酶-反义RNA1(NNT-AS1)、微小RNA-22-3p(miR-22-3p)在子宫内膜癌(EC)中表达的相关性及二者与患者临床病理特征、预后的关系。方法 收集2015年1月至2016年11月期间于中部战区总医院进行手术的104例EC患者切除的EC组织和癌旁正常组织,同时收集整理患者国际妇产科联盟(FIGO)分期、淋巴结转移、肌层浸润深度等临床资料。检测组织中lncRNA NNT-AS1、miR-22-3p的相对表达水平;EC组织中lncRNA NNT-AS1与miR-22-3p表达的相关性采用Pearson相关分析;EC组织中lncRNA NNT-AS1和miR-22-3p表达与患者预后的关系采用Kaplan-Meier法分析;多因素Cox回归分析EC患者预后的影响因素。结果 与癌旁正常组织相比,EC组织中lncRNA NNT-AS1表达水平明显较高,miR-22-3p表达水平明显较低(P<0.05)。FIGO分期为Ⅲ+Ⅳ期、发生淋巴结转移、浸润深度≥1/2的EC患者miR-22-3p低表达、lncRNANNT-AS1高表达的比例高于FIGO分期为Ⅰ+Ⅱ期、未发生淋巴结转移、浸润深度<1/2的EC患者(P<0.05)。Pearson相关分析显示,EC组织中lncRNA NNT-AS1相对表达水平与miR-22-3p呈负相关(r=-0.355,P<0.05)。EC组织中miR-22-3p高表达患者5年总生存率高于miR-22-3p低表达患者,lncRNANNT-AS1高表达患者5年总生存率低于lncRNANNT-AS1低表达患者(P<0.05)。lncRNA NNT-AS1、FIGO分期是EC患者死亡的独立危险因素(P<0.05),miR-22-3p是EC患者死亡的保护因素(P<0.05)。结论 EC组织中lncRNA NNT-AS1与miR-22-3p表达水平呈负相关,且二者均与患者FIGO分期等临床病理特征及预后有密切联系。

干扰LncRNA表达减轻非小细胞肺癌细胞对紫杉醇耐药的机制研究

目的研究干扰长链非编码RNA烟酰胺核苷酸转氢酶反义RNA1(LncRNA NNT-AS1)表达减轻非小细胞肺癌(NSCLC)细胞对紫杉醇(TAX)耐药的机制。方法构建NSCLC TAX耐药细胞系(A549/TAX),检测正常、亲本、耐药细胞中LncRNA NNT-AS1的表达情况,并验证miR-582-5p与LncRNA NNT-AS1、HMGB2的靶向关系;体外培养A549/TAX细胞,观察单独干扰LncRNA NNT-AS1或同时干扰LncRNA NNT-AS1、miR-582-5p对细胞中LncRNA NNT-AS1、miR-582-5p、HMGB2 mRNA及其蛋白表达以及细胞活力、克隆形成、凋亡的影响;通过裸鼠成瘤实验观察干扰LncRNA NNT-AS1对肿瘤生长及肿瘤组织中miR-582-5p、HMGB2 mRNA及其蛋白表达的影响。结果与正常细胞比较,LncRNA NNT-AS1在亲本、耐药细胞中均呈高表达(P<0.05),且有递增趋势。经验证,miR-582-5p与LncRNA NNT-AS1、HMGB2均存在靶向关系。干扰LncRNA NNT-AS1表达后,A549/TAX细胞中LncRNA NNT-AS1、HMGB2 mRNA及其蛋白的表达水平以及细胞活力、克隆形成数均显著降低,而miR-582-5p的表达水平、细胞凋亡率均显著升高(P<0.05);同时干扰miR-582-5p表达可使上述改变得以逆转(P<0.05)。干扰肿瘤细胞中LncRNA NNT-AS1的表达后,荷瘤裸鼠的肿瘤体积和肿瘤质量均显著降低,miR-582-5p的表达水平显著升高,HMGB2 mRNA及其蛋白的表达水平均显著降低(P<0.05)。结论干扰LncRNA NNT-AS1的表达可靶向上调miR-582-5p的表达并下调HMGB2的表达,进而减轻NSCLC TAX化疗耐药。

肿瘤中烟酰胺核苷酸反义转氢酶RNA1的作用研究

烟酰胺核苷酸反义转氢酶RNA1(nicotinamide nucleotide transhydrogenase-antisense RNA1,NNT-AS1)作为一种新近发现的在肿瘤中异常表达的长链非编码RNA,其在肿瘤中作用的相关研究也获得了突破性进展。现有研究已证实NNT-AS1广泛参与多种肿瘤的发生和发展,其对肿瘤的诊断、治疗都有重要意义。全文将对NNT-AS1与肿瘤的研究进展作一综述。