芪地糖肾方调控NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路介导高糖刺激肾小球内皮细胞焦亡的研究

目的 探究芪地糖肾方通过NOD样受体家族热蛋白结构域相关蛋白3/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1/消皮素D蛋白(NLRP3/Caspase-1/GSDMD)通路介导高糖刺激的肾小球内皮细胞焦亡的作用。方法 将肾小球内皮细胞分为正常组、高糖组、芪地糖肾方组,分别予完全培养基、30 mmol/L高糖培养基、30 mmol/L高糖培养基+芪地糖肾方100μg/mL培养48 h,采用细胞免疫荧光染色法观察细胞中NLRP3表达情况及细胞骨架情况,采用Western blot法检测细胞中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)、消皮素D蛋白(GSDMD)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)表达情况。结果 与正常组比较,高糖组细胞中NLRP3、Caspase-1、GSDMD、ASC、IL-18、IL-1β蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05),NLRP3荧光表达信号增强,细胞骨架损伤明显;与高糖组比较,芪地糖肾方组NLRP3、Caspase-1、GSDMD、ASC、IL-18、IL-1β蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05),NLRP3荧光表达信号减弱,细胞骨架损伤状态改善。结论 芪地糖肾方可通过抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD焦亡相关通路激活改善高糖诱导的肾小球内皮细胞损伤。

艾司洛尔通过阻断NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路抑制早期脓毒症大鼠心脏炎症反应及焦亡

目的研究艾司洛尔(Esmolol,ES)是否可通过抑制焦亡的经典通路进而发挥心脏保护作用。方法 72只大鼠随机分为假手术(sham operation,Sham)组、盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)组和ES组,每组24只。每组随机抽取8只大鼠观察生存情况,剩余16只大鼠根据处理时间分为6 h和24 h两个亚组,每组8只。Sham组仅给予开腹,翻动盲肠处理;CLP组和ES组采用CLP法建立脓毒症大鼠模型。Sham组、CLP组持续经大鼠左颈内静脉泵入生理盐水6 h;ES组持续泵入艾司洛尔稀释液6 h。分别于相应时间点处死大鼠,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清IL-1β、IL-18水平,采用免疫印迹法(Western blot)检测心肌组织NLRP3、Caspase-1及GSDMD蛋白表达水平;光学显微镜下观察心肌病理改变;荧光显微镜下观察心肌细胞焦亡情况。结果 (1)ELISA结果显示,与各时间点的Sham组比较,ES组大鼠血清IL-1β及IL-18水平均明显升高,24 h组最高;而与CLP组比较,上述因子水平在6 h与24 h均明显下降(P <0.05)。(2)Western blot结果显示,术后各时间点,大鼠心肌组织中焦亡经典通路相关蛋白[NOD样受体蛋白3(nucleotide-binding domain(NOD)-like receptor protein 3,NLRP3)、天冬氨酸蛋白水解酶-1 (cysteinyl aspartate-specific proteases-1,Caspase-1)、消皮素D(Gasdermin D,GSDMD)]在CLP组均显示出高表达状态,较Sham组明显升高(P <0.05),24 h组表达量最高,而ES组各时间点上述蛋白表达水平均较CLP组有所减少,且差异统计学意义(P <0.05)。(3)病理结果显示,Sham组大鼠心肌组织可见轻微的病理损伤,CLP组心肌细胞损伤最重,ES组大鼠的心肌细胞破坏较CLP组减轻程度多,各组24 h损伤程度均较6 h重。(4)24 h Tunel与DAPI染色显示,与Sham组可见的少量阳性细胞比较,CLP组可见大量被染色的阳性细胞,且差异有统计学意义(P <0.05);而与CLP组比较,ES组心肌细胞阳性染色数量明显减少(P <0.05)。(5) 7 d生存分析显示,CLP组大鼠死亡率最高,ES组大鼠生存天数较CLP组明显延长,差异有统计学意义(P <0.01)。结论 ES能减轻心肌损伤,提高脓毒症大鼠生存率,其机制可能与抑制焦亡经典通路中NLRP3/Caspase-1/GSDMD蛋白表达及减少炎症因子释放有关。

基于NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路探讨补中益气汤干预NOD.H-2^(h4)小鼠AIT细胞焦亡的机制

目的:基于NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)/胱天蛋白酶-1(Caspase-1)/消皮素D(GSDMD)通路探讨补中益气汤对自身免疫性甲状腺炎(AIT)小鼠细胞焦亡的作用机制。方法:60只NOD.H-2h4小鼠分为正常组、模型组、补中益气汤低、中、高剂量(4.10、8.19、16.38 g·kg^(-1))组和硒酵母片(0.26 mg·kg^(-1))组,每组10只。除正常组外,其余各组均给予0.05%碘化钠(NaI)灌胃8周造模,继续给药干预8周。酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清甲状腺过氧化物酶抗体(TPO-Ab)、甲状腺球蛋白抗体(Tg Ab)水平;苏木素-伊红(HE)染色观察小鼠甲状腺组织病理学改变;免疫组化法检测甲状腺组织中NLRP3、Caspase-1、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)蛋白表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测甲状腺组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测甲状腺组织中细胞焦亡相关蛋白水平。结果:与正常组比较,模型组小鼠血清TPO-Ab、Tg Ab水平显著升高(P<0.01),甲状腺滤泡或增大呈立方状,或破坏萎缩,滤泡周围可见大量淋巴细胞浸润;与模型组比较,给药组TPO-Ab、Tg Ab水平显著降低(P<0.01),滤泡形态结构有所改善,淋巴细胞浸润程度有所减轻,其中补中益气汤中剂量组降低和改善效果最为明显。与正常组比较,模型组小鼠甲状腺组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白阳性产物和mRNA表达显著增加(P<0.01),NLRP3、剪切的(cleaved) Caspase-1、IL-1β、IL-18、GSDMD-N蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,给药组NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白阳性产物和mRNA表达明显降低(P<0.05,P<0.01),其中补中益气汤中剂量组降低效果最为明显,给药组NLRP3、cleaved Caspase-1、IL-1β、IL-18、GSDMD-N蛋白表达水平明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论:补中益气汤可改善AIT,其机制可能是通过调控NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路抑制细胞焦亡实现的。

益气养阴活血方对糖尿病肾病大鼠NLRP3/Caspase-1/GSDMD细胞焦亡通路的影响

目的:基于NOD样受体蛋白3(NLRP3)/胱天蛋白酶^(-1)(Caspase^(-1))/消皮素D(GSDMD)细胞焦亡通路,探讨益气养阴活血方防治糖尿病肾病(DKD)肾脏损伤的可能作用机制。方法:随机将50只雄性SD大鼠分为正常组8只、造模组42只。造模组高糖高脂饮食6周后予一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱导建立DKD大鼠模型。造模成功后随机分为模型组、缬沙坦组(8.33 mg·kg^(-1))、益气养阴活血方低、高剂量组(11、22 g·kg^(-1))。连续灌胃6周后检测各组大鼠空腹血糖(FBG)、总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)及24 h尿蛋白定量(24 h-UTP);苏木素-伊红(HE)染色观察肾组织病理形态学变化;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清白细胞介素^(-1)β(IL-1β)、白细胞介素^(-1)8(IL^(-1)8)水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)、实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测各组大鼠肾组织NLRP3/Caspase^(-1)/GSDMD蛋白及其mRNA表达水平。结果:与正常组比较,模型组大鼠FBG、CHO、TG、BUN、SCr、24 h-UTP及血清IL-1β、IL^(-1)8水平均显著升高(P<0.01),肾组织病变程度严重,且肾组织NLRP3/Caspase^(-1)/GSDMD蛋白及其mRNA表达水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,各药物组FBG、CHO、TG、BUN、SCr、24 h-UTP及血清IL-1β、IL^(-1)8水平均明显下降(P<0.05,P<0.01),肾组织病变程度得到改善,且肾组织NLRP3/Caspase^(-1)/GSDMD蛋白及其mRNA表达水平明显降低(P<0.05,P<0.01),以益气养阴活血方高剂量组效果最佳。结论:益气养阴活血方可通过调控NLRP3/Caspase^(-1)/GSDMD通路抑制细胞焦亡,缓解DKD大鼠炎症反应,减轻肾脏病理损伤。

基于NLRP3/Caspase-1/GSDMD炎性焦亡途径探讨参芪抑瘤方联合顺铂对H22肝癌荷瘤小鼠的作用机制

目的:探讨参芪抑瘤方干预细胞焦亡在抗肿瘤效应中的作用机制。方法:随机抽取10只BALB/c小鼠(雄性)作为正常组,余40只建立肝癌小鼠异位移植瘤模型,建模5 d后随机分为模型组、顺铂组[2.5×10^(-3)g·kg^(-1)·(3 d)^(-1)]、参芪抑瘤方组(27 g·kg^(-1)·d^(-1))、联合组(参芪抑瘤方+顺铂)。正常组与模型组以等量生理盐水灌胃,连续干预10 d,观察各组小鼠一般情况,干预结束后,称量小鼠瘤体质量,计算抑瘤率,采用苏木素-伊红(HE)染色观察肿瘤组织病理变化;检测小鼠肝功能指标丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平;原位末端标记法(TUNEL)检测小鼠肿瘤组织细胞DNA损伤情况;免疫组化(IHC)、免疫荧光(IF)及蛋白免疫印迹法(Western blot)检测瘤组织中NOD样受体蛋白3(NLRP3)、胱天蛋白酶-1(Caspase-1)、消皮素D(GSDMD)蛋白表达水平;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测瘤组织中白细胞介素(IL)-1β和IL-18的含量。结果:与正常组比较,模型组小鼠精神状态差,倦卧懒动,毛色暗淡;肝功能检测血清ALT、AST水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较,各给药组小鼠精神状态明显好转,且各给药组均可不同程度抑制瘤体生长,肿瘤质量均下降,其中联合组抑瘤率最强(P<0.01);HE染色示,模型组小鼠肿瘤组织病理形态学病变显著,各给药组均有一定程度改善,以参芪抑瘤方组及联合组细胞核,溶解破裂更为明显;肝功能检测中,参芪抑瘤方组及联合组小鼠血清ALT、AST水平均下降显著(P<0.01);各给药组炎症因子IL-1β和IL-18均下降(P<0.05,P<0.01);TUNEL染色示各给药组干预后TUNEL染色阳性降低(P<0.05,P<0.01),以顺铂组和参芪抑瘤方组降低显著(P<0.01);Western blot、免疫组化、免疫荧光在肿瘤组织中检测发现,各给药组NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达水平均下降(P<0.05,P<0.01)。与顺铂组比较,参芪抑瘤方组和联合组小鼠精神状态佳,瘤体形态规则,联合组小鼠肿瘤质量下降(P<0.05);参芪抑瘤方组ALT和AST水平下降(P<0.05);参芪抑瘤方组和联合组IL-1β和IL-18均下降(P<0.05,P<0.01),以联合组最为明显(P<0.01);免疫组化结果显示,联合组小鼠肿瘤组织中GSDMD蛋白表达显著降低(P<0.01);免疫荧光检测发现参芪抑瘤方组NLRP3在肿瘤组织中表达显著降低(P<0.01);Western blot结果显示参芪抑瘤方组及联合组NLRP3蛋白表达水平下降显著(P<0.01),联合组Caspase-1蛋白表达水平下降显著(P<0.01);GSDMD蛋白表达下降不明显,差异无统计学意义。结论:参芪抑瘤方联合顺铂具有明显抑瘤作用,其抗肿瘤作用可能是通过下调NLRP3/Caspase-1/GSDMD炎性焦亡途径抑制细胞焦亡,缓解肝癌小鼠的炎症反应,达到抗肿瘤的作用。