维生素D在NOD.H-2^h4小鼠实验性自身免疫性甲状腺炎中的作用研究

目的探讨维生素D在NOD.H-2^h4小鼠(4周龄、平均体质量约20 g)实验性自身免疫性甲状腺炎中的作用。方法选取45只雌性NOD.H-2^h4小鼠随机分为3组:对照组NOD.H-2^h4小鼠(15只)同步用无菌双蒸水喂养8周;实验组NOD.H-2^h4小鼠(15只)使用含0.005%(50 mg/L)碘化钠的无菌双蒸水(大约为100倍正常碘的摄入量)喂养8周,同时每2天给予无菌花生油5μg/kg口服;维生素D干预组NOD.H-2^h4小鼠(15只)使用含0.005%(50 mg/L)碘化钠的无菌双蒸水(大约为100倍正常碘的摄入量)喂养8周,同时每2天给予5μg/kg活性维生素D3口服。所有NOD.H-2^h4小鼠均在实验第8周后经麻醉处死。各组NOD.H-2^h4小鼠血液标本抽取后离心,分离血清,采用电化学发光免疫分析法检测甲状腺素、甲状腺球蛋白抗体(TgAb)、甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)水平;采用ELISA检测NOD.H-2^h4小鼠血清白细胞介素(IL)-17、IL-23水平;留取NOD.H-2^h4小鼠甲状腺,HE染色观察淋巴细胞浸润情况,并计算自身免疫性甲状腺炎的发生率。结果实验组和维生素D干预组NOD.H-2^h4小鼠自身免疫性甲状腺炎发生率分别为93.3%和86.6%,与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);与对照组比较,实验组和维生素D干预组NOD.H-2^h4小鼠血清TgAb、TPOAb、IL-17、IL-23水平均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与实验组比较,维生素D干预组NOD.H-2^h4小鼠甲状腺组织形态破坏及淋巴细胞浸润程度明显降低,血清TgAb、TPOAb、IL-17、IL-23水平均明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论维生素D可能与自身免疫性甲状腺炎的发病及严重程度有关。

MicroRNA-155在碘致NOD.H-2h4小鼠自身免疫性甲状腺炎发病中的变化研究

目的:观察高碘诱发NOD.H-2 h4小鼠发生自发性自身免疫性甲状腺炎(SAT)动物模型中Th1及Th2细胞的动态变化及甲状腺、脾脏、肝脏、肾脏中mi R-155的动态改变,探讨mi R-155对碘致自身免疫性甲状腺炎(AIT)的可能影响及作用机制。方法:4周龄NOD.H-2 h4雌性小鼠随机分为对照组及高碘饮水组。高碘组饲以含0.05%碘化钠的无菌水,对照组饲以无菌双蒸水,于实验开始后第0、2、4、6、8、10、12周麻醉处死。留取甲状腺,制备石蜡切片行HE染色;酶联免疫吸附试验测定血清甲状腺球蛋白抗体(Tg Ab)水平;流式细胞仪检测脾脏单个核细胞悬液Th1、Th2细胞表达水平;实时定量RT-PCR检测脾细胞中Th1和Th2细胞转录因子T-bet及GATA-3,细胞因子IFN-γ及IL-4的m RNA表达水平及甲状腺、脾脏、肝脏、肾脏mi RNA-155表达水平。结果:发生SAT的小鼠血清Tg Ab滴度较对照组升高(P<0.05)。脾细胞中Th1细胞比例及T-bet,IFN-γm RNA表达量自6周后较对照组升高(P<0.05)。脾脏、甲状腺miR-155表达量分别自8周及10周后较对照组升高(P<0.05)。脾脏mi R-155水平与Tg Ab滴度显著正相关(r=0.825,P<0.01),与Th1细胞比例显著正相关(r=0.872,P<0.01);甲状腺mi R-155水平与TgAb滴度显著正相关(r=0.575,P<0.01);与Th1细胞比例显著正相关(r=0.642,P<0.01)。结论:发生SAT的NOD.H-2 h4小鼠脾脏Th1细胞比例显著升高,提示Th1细胞可能参与该模型AIT的发生发展,占免疫优势地位。脾脏及甲状腺mi R-155水平与Tg Ab滴度及Th1细胞比例显著正相关,提示mi R-155可能通过影响Th1细胞在AIT的发生发展中发挥作用。

富碘中药复方与碘过量对碘缺乏NOD.H-2^(h4)小鼠甲状腺Th17细胞分化影响的比较

目的比较富碘中药复方与碘过量对碘缺乏NOD.H-2h4小鼠甲状腺IL-23/IL-17炎症轴的影响。方法选雌性8周龄NOD.H-2h4小鼠,给低碘饲料,饮双蒸水,喂养90天后制成自身免疫甲状腺炎易感碘缺乏甲状腺肿模型,后随机分成4组:正常对照组(NC)、模型对照组(MC)、富碘中药复方组[(HIE),海藻15g,昆布15g,海带7.5g,碘含量1900.36μg/L]和碘过量组[(IE)含碘1900μg/L的去离子水,用碘酸钾配制]。再给处理因素90 d后处死小鼠。放射免疫分析法(RIA法)测小鼠血清总T3(TT3)、总T4(TT4)。IRMA法测定小鼠血清促甲状腺激素(TSH)。光镜下观察甲状腺滤泡形态。用免疫组化方法测定甲状腺间质细胞CD68及IL-17的表达。实时定量(RT-PCR)法检测NOD小鼠甲状腺IL-17mRNA和IL-23mRNA表达。Western blot蛋白印迹杂交法测定小鼠甲状腺IL-17和IL-23的蛋白表达。结果给处理因素90 d后,各组间血清TT3﹑TT4及TSH值比较均无明显差异(P﹥0.05)。NC,MC,IE及HIE组小鼠自身免疫甲状腺炎的发生率分别为:2/10,0/10,9/10,3/10。与IE组相比,HIE组的甲状腺间质细胞CD68的表达水平(整合光密度0.28±0.07 vs 0.13±0.06)明显降低(P﹤0.01);HIE组小鼠甲状腺组织中IL-17的表达水平(整合光密度0.21±0.07vs 0.19±0.05)明显降低(P﹤0.01)。HIE组IL-17mRNA及IL-23mRNA平均相对表达量(1.31±0.06;1.43±0.50),明显低于IE组(2.39±0.05;2.21±0.70),P均<0.05。HIE组的IL-17及IL-23的蛋白表达量(0.73±0.02;0.27±0.02),明显低于IE组(0.80±0.03;0.36±0.03),P均﹤0.05。结论与单纯碘过量相比,富碘中药复方能明显降低碘缺乏NOD.H-2h4小鼠碘致自身免疫甲状腺炎的发生率,其机理可能与富碘中药复方能明显抑制碘补充过程中甲状腺内IL-23、IL-17的高表达有关。

MicroRNA-146参与碘诱导NOD.H-2h4小鼠自身免疫性甲状腺炎

目的:观察自身免疫性甲状腺炎(AIT)NOD.H-2h4小鼠microRNA-146(miR-146)的表达水平。方法:选取4周龄NOD.H-2h4雌性小鼠随机分为正常饮水(无菌双蒸水)组和高碘饮水(0.05%碘化钠水)组。甲状腺HE染色观察淋巴细胞浸润情况;获取CD4^+ T细胞及甲状腺组织small RNAs,RT-PCR检测miR-146表达水平;检测心、肝和肾中miR-146的表达水平。结果:高碘饮水组NOD.H-2h4小鼠甲状腺组织有不同程度的淋巴细胞浸润,甲状腺炎的发生率均高于对照组。与对照组相比,高碘饮水组小鼠脾脏CD4^+ T细胞和甲状腺中miR-146水平显著升高。高碘饮水组小鼠与对照组相比,心、肝和肾中miR-146的水平没有明显差别。结论:在NOD.H-2h4小鼠AIT模型中,甲状腺和脾脏CD4^+ T miR-146水平升高,可能参与自身免疫性甲状腺炎的发生和发展。

NOD.H-2h4小鼠自身免疫性甲状腺炎中细胞凋亡及凋亡相关蛋白Fas、Fas-L和FLIP的表达

目的观察NOD.H-2h4小鼠自身免疫性甲状腺炎时甲状腺内细胞凋亡和凋亡相关蛋白Fas、Fas-L和FLIP的表达情况,研究细胞凋亡在自身免疫性甲状腺炎中的作用。方法7~8周龄的NOD.H-2h4小鼠,饲以0.05%NaI溶液作为实验组,对照组小鼠则饲以自来水。在给碘后8,16,32周处死小鼠,HE染色观察甲状腺的炎症程度,TUNEL方法观察甲状腺内细胞凋亡情况,免疫组化方法观察凋亡相关蛋白Fas、Fas配体(Fas-L)和FLICE抑制蛋白(FLIP)的表达情况。结果实验组小鼠出现自身免疫性甲状腺炎,对照组无甲状腺炎产生。甲状腺炎时,TUNEL染色阳性细胞主要集中在浸润淋巴细胞中,甲状腺滤泡上皮细胞罕见凋亡;Fas、Fas-L和FLIP主要表达在甲状腺内的浸润淋巴细胞上;部分甲状腺滤泡上皮细胞表达Fas,而Fas-L和FLIP在甲状腺滤泡上皮细胞未见明显表达。结论NOD.H-2h4小鼠自身免疫性甲状腺炎时甲状腺细胞无明显凋亡,提示细胞凋亡机制未参与甲状腺炎的发病。甲状腺内浸润淋巴细胞虽然表达Fas但并未出现明显凋亡,这可能与其同时表达抗凋亡蛋白FLIP有关。

富碘中药复方与碘过量对碘缺乏NOD.H-2^(h4)小鼠心、肾2型脱碘酶mRNA表达的影响

目的:研究富碘中药复方及碘过量对于碘缺乏NOD.H-2h4小鼠心、肾2型脱碘酶(D2)mRNA表达的影响。方法:选雌性8周龄NOD.H-2h4小鼠,给予双蒸水及低碘饲料喂养90d后制成碘缺乏自身免疫性甲状腺炎易感的甲状腺肿模型。随机分为正常对照组(NC)、低碘组(LI)、碘过量组(IE)(碘酸钾配制的含碘1900μg/L的去离子水)、富碘中药复方组(HIE)(海藻15g、昆布15g、海带7.5g,碘含量1900.36μg/L)。给予处理因素90d后处死。应用放射免疫RIA法测小鼠血清总T3(TT3)、总T4(TT4)。IRMA法测定小鼠血清促甲状腺激素(TSH)。光镜观察甲状腺组织细胞形态。应用实时定量RT-PCR法测定小鼠心、肾D2mRNA的表达情况。结果:给予处理因素90d后,各组间血清TT3,TT4及TSH值比较均未见明显差异(P>0.05)。NC、LI、IE与HIE组小鼠自身免疫性甲状腺炎的发生率分别为:2/10、0/10、9/10、3/10。小鼠心D2mRNA的表达,LI组(1.76±0.34)与NC组(1.02±0.25)相比有明显的升高趋势(P<0.01),IE组(1.42±0.33)的表达显著高于HIE组(0.76±0.32)的表达(P<0.05);小鼠肾D2mRNA的表达,IE组(4.07±0.88)较HIE组(1.91±0.62)升高趋势明显(P<0.01)。结论:摄碘量相同的情况下,单纯碘过量可致NOD.H-2h4小鼠心、肾D2表达增加,富碘中药复方亦可致小鼠肾D2表达增加,小鼠心中未见此变化。

黄芪多糖对自身免疫性甲状腺炎NOD.2^(h4)小鼠血清炎症因子及甲状腺组织的影响

目的观察黄芪多糖(APS)对自身免疫性甲状腺炎(AIT)NOD.2^(h4)小鼠血清炎症因子、甲状腺抗体和甲状腺组织病理形态的影响。方法选取90只6~8周龄SPF级雌性NOD.H-2^(h4)小鼠,体质量(25±5)g,随机分为空白对照组、模型组、硒制剂组及黄芪多糖低、中、高剂量组,共6组,每组15只。黄芪多糖低、中、高剂量组每日分别予以200,400,800mg·kg^(-1)黄芪多糖灌胃,硒制剂组每日予以0.26mg·kg^(-1)亚硒酸钠片灌胃,空白对照组及模型剂组每日予以等体积蒸馏水灌胃,连续灌胃给药8周。观察小鼠一般状况,酶联免疫试剂盒(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)检测各组小鼠血清中白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-17(IL-17)、转化生长因子β1(TGF-β1)、抗甲状腺球蛋白抗体(TgAb)、促甲状腺激素(TSH)水平,HE染色观察各组小鼠甲状腺淋巴细胞浸润情况。结果与空白对照组比较,模型组血清IL-6、IL-12、IL-17、TgAb显著升高,其余各治疗组均有所降低,且差异具有统计学意义(P<0.001)。与空白对照组比较,模型组血清IL-10、TGF-β1水平显著下降,其余各治疗组均有所升高,且差异具有统计学意义(P<0.001)。与空白对照组比较,其余组小鼠血清TSH均有所升高,但各组间差异没有统计学意义,证实非甲亢、甲减期。HE染色可见AIT组小鼠甲状腺淋巴细胞浸润显著,各治疗组甲状腺淋巴细胞浸润情况均有所恢复。结论黄芪多糖可能通过调节甲状腺自身免疫功能,抑制促炎细胞因子释放,减轻甲状腺淋巴细胞炎症浸润程度,起到延缓AIT发生的作用。

溴氯哌喹酮干预对NOD.H-2^h4小鼠自身免疫甲状腺炎发病的影响及机制研究

观察高碘诱发自身免疫性甲状腺炎动物模型中CD4^＋ CD25^＋调节性T细胞、Th17细胞的变化及溴氯哌喹酮（HF）干预对其影响选取NOD.H-2h4雌鼠饮0.005％碘化钠水,皮下注射HF干预.观察淋巴细胞浸润情况并进行甲状腺炎症程度评分,测定甲状腺球蛋白抗体（TgAb）水平,分析CD4^＋ CD25^＋ Foxp3^＋调节性T细胞、Th17比例的变化,实时定量PCR检测Foxp3、IL-17和RORγt mRNA表达水平.NOD.H-2^h4小鼠饮高碘水后甲状腺炎的发生率明显高于对照组,甲状腺组织有不同程度的淋巴细胞浸润,甲状腺相对重量及TgAb水平均较对照组明显升高（P＜0.05）.发生自发性自身免疫性甲状腺炎（SAT）的小鼠脾细胞中CD4^＋ CD25^＋ Foxp3^＋调节性T细胞所占比例和Foxp3 mRNA表达量均较对照组明显降低（P＜0.01）;Th17所占比例和IL-17、RORγt mRNA表达水平均较对照组明显升高（P＜0.05）.与SAT非HF治疗组相比,HF治疗组CD4^＋ CD25^＋ Foxp3^＋调节性T细胞的比例和Foxp3 mRNA表达量均无明显变化（P＞O.05）;但Th17比例及IL-17、RORγt mRNA表达水平均明显减低（P＜0.01）.同时,HF治疗组TgAb滴度以及淋巴细胞浸润程度均较同周龄SAT非HF治疗组明显降低（P＜0.05）.

慢性碘过量对具有自身免疫遗传倾向的NOD.H-2h4小鼠甲状腺功能和形态影响的实验研究

探讨慢性碘过量对具有自身免疫遗传背景的NOD.H-2h4小鼠甲状腺组织形态、超微结构和功能影响的剂量、时间效应关系.碘过量以剂量依赖和时间依赖的方式导致NOD,H-2h4小鼠甲状腺肿和甲状腺上皮细胞超微结构的损伤.

芪蛎消瘿汤对NOD.H-2h4小鼠甲状腺IL-23/IL-17轴的调控影响

目的:从辅助性T细胞17(Th17)细胞分化的调控角度,探讨芪蛎消瘿汤治疗自身免疫甲状腺炎(AIT)的作用机制。方法:雌性8周龄NOD.H-2h4小鼠,随机分成4组。正常组(NC)饲以双蒸水,模型组(MC)、常规剂量中药组(ZY1)和3倍剂量中药组(ZY3)自由饮用含0.05%碘化钠水8周成模后,再灌胃给药8周。RIA法测血清TT3、TT4,IRMA法测血清TSH;光镜下观察甲状腺细胞形态;免疫组化法及RT-PCR法分别检测甲状腺IL-6、TGF-β表达;Western Blot法检测甲状腺RORγt、RORα、STAT3蛋白表达。结果:各组间血清TT3、TT4及TSH值比较无统计学差异;与NC组比较,MC组AIT的发生率,IL-6、TGF-βmRNA及蛋白表达,RORγt、RORα、STAT3表达显著升高(P<0.01);与MC组比较,ZY1组IL-6、TGF-β、RORα、STAT3、RORγt表达均明显下降(P<0.01),ZY3组IL-6、TGF-β的整合光密度值及RORα、STAT3表达明显下降(P<0.01),ZY3组RORγt表达下降(P<0.05)。结论:芪蛎消瘿汤可能通过下调IL-6、TGF-β、RORγt、RORα、STAT3的表达而调控IL-23/IL-17炎症轴起到治疗AIT的作用。

芪蛎消瘿汤对NOD.H-2h4小鼠甲状腺CD4＋T细胞亚群影响的实验研究

目的:从CD4+T细胞亚群角度,探讨芪蛎消瘿汤治疗自身免疫甲状腺炎(AIT)的作用机制。方法:60只SPF级NOD.H-2h4小鼠,随机分成以下4组:正常(NC)组、模型(MC)组、常规剂量芪蛎消瘿汤组(ZY1,20.8 g·kg-1)、和3倍剂量芪蛎消瘿汤组(ZY3,62.4 g·kg-1),正常组饲以双蒸水,其余各组自由饮用含0.05%碘化钠水8周,8周后自发形成AIT动物模型,再给处理因素8周后处死小鼠,留取各组NOD.H-2h4小鼠血清、甲状腺。放免法(RIA法)测小鼠血清总三碘甲状腺原氨酸(TT3)、总甲状腺素(TT4),固相化学发光酶免疫法(IRMA法)测定小鼠血清促甲状腺激素(TSH);光镜下观察甲状腺细胞形态;免疫组化法测定小鼠甲状腺γ-干扰素(INF-γ)、白细胞介素-4(IL-4)蛋白表达;RT-PCR法检测小鼠甲状腺INF-γ,IL-4mRNA表达;Western blot法测定小鼠甲状腺组织叉头翼状螺旋转录因子(Foxp3)蛋白表达。结果:各组间血清TT3,TT4及TSH值比较无明显差异。HE染色显示MC组甲状腺组织淋巴细胞浸润,MC组AIT的发生率明显高于NC组(P<0.01)。MC组INF-γ,IL-4 mRNA及蛋白表达较NC组显著下降(P<0.01);与MC组比较,ZY1,ZY3组INF-γ,IL-4的蛋白表达升高(分别P<0.01,P<0.05);且ZY1组,ZY3组INF-γ,IL-4mRNA表达显著升高(P<0.01)。MC组甲状腺组织Foxp3的蛋白表达量较NC组明显下降(P<0.01);ZY1,ZY3组Foxp3表达较MC组明显升高(P<0.01)。结论:芪蛎消瘿汤治疗AIT的机制可能与上调INF-γ,IL-4,Foxp3的表达,影响NOD.H-2h4小鼠Th1,Th2,Treg细胞亚群水平相关。

碘致NOD.H-2^(h4)小鼠自身免疫甲状腺炎的实验研究

目的探讨碘致自身免疫甲状腺炎发生过程中炎性细胞浸润和甲状腺自身抗体的动态变化。方法NOD.H-2^(h4)和昆明种小鼠各128只随机分入普通水组和0.05%碘化钠水组,分组后1、2、4、8、12、16、24周小鼠眶静脉取血,测定血清自身抗体和甲状腺激素,甲状腺组织制作石蜡切片,HE染色。结果NOD.H-2^(h4)小鼠饮用0.05%碘化钠水1周即有自身免疫性甲状腺炎的发生,补碘12周时患病率和炎性细胞浸润程度达最高峰。补碘8周,其血清TgAb开始升高,之后随着补碘时间的延长,其水平逐渐增高,而对照组血清TgAb始终保持低平曲线。结论碘过量可以促进NOD.H-2^(h4)小鼠自身免疫甲状腺炎(甲状腺淋巴细胞浸润)的发生和发展,血清TgAb是其炎症反应的一个标志。

硫酸胆固醇对桥本氏甲状腺炎小鼠模型的治疗效果及相关机制研究

目的观察硫酸胆固醇(CS)对桥本氏甲状腺炎小鼠的治疗效果。方法选取NOD.H-2^(h4)雌性小鼠饮0.05%碘化钠水持续不同时间,并通过持续2周腹腔注射CS对诱导小鼠进行治疗。HE染色观察淋巴细胞浸润情况并进行甲状腺炎症程度评分;测定血清抗甲状腺球蛋白抗体(TgAb)、甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)以及甲状腺功能水平;免疫荧光染色流式细胞仪分析B淋巴细胞、调节性T细胞(Treg)、Th17、Th1、Th2细胞比例的变化。结果HE染色结果显示,在8周组和16周组中,经过CS的腹腔注射后,小鼠甲状腺组织炎性评分显著下降(P<0.05)。而在64周组中,治疗组与诱导组之间无显著差别(P=0.31)。血清学分析显示,经过CS干预后,高碘溶液诱导8周和16周的小鼠体内TgAb、TPOAb水平均显著降低(P<0.05),而小鼠的甲状腺功能(TSH、T4水平)仅在16周组出现显著变化。流式细胞术分析显示,在8周组中,经过CS干预后,小鼠体内B淋巴细胞以及Th1、Th2、Th17和Treg细胞比例均出现显著变化(P<0.05)。结论CS对于桥本氏甲状腺炎早中期的疾病进展具有明显的治疗及缓解效果。

自身免疫性甲状腺炎小鼠发病中调节性T细胞、Th17细胞的变化

目的观察高碘诱发自身免疫性甲状腺炎(AIT)动物模型中CD4+CD25+调节性T细胞、Th17细胞的变化。方法选取NOD.H-2h4雌鼠饮0.005%碘化钠水,HE染色观察淋巴细胞浸润情况并进行甲状腺炎症程度评分;测定血清甲状腺球蛋白抗体(TgA b)水平;免疫荧光染色流式细胞仪分析CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞、Th17细胞比例的变化;实时定量RT-PCR检测Foxp3 mRNA、IL-17 mRNA、RORγt mRNA表达水平。结果 NOD.H-2h4小鼠高碘饮水后,甲状腺炎的发生率明显高于对照组,甲状腺组织有不同程度的淋巴细胞浸润,甲状腺相对重量及血清TgA b水平均较对照组小鼠明显升高(P<0.05)。脾细胞中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞所占比例和Foxp3 mRNA表达量均较对照组明显降低(P<0.01);脾细胞中Th17细胞所占比例和IL-17 mRNA表达量、RORγt mRNA表达水平均较对照组明显升高(P<0.05)。结论 NOD.H-2h4小鼠在高碘诱导发生甲状腺炎时,脾脏CD4+CD25+调节性T细胞比例明显降低,Th17细胞比例明显升高。

碘致甲状腺滤泡上皮细胞损伤在甲状腺炎发生机制中的探讨

目的探讨过量碘对甲状腺滤泡上皮超微结构的影响，从而探讨甲状腺损伤与自身免疫甲状腺炎之间的关系。方法NOD．H-2^h4和昆明小鼠随机分入饮用正常水组和5倍、10倍、100倍高碘水组。各组动物分别于实验开始后4、8及24周处死，锇酸固定，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色，透射电镜成像。结果碘过量造成NOD．H-2^h4小鼠甲状腺上皮细胞过氧体和次级溶酶体数量增多、上皮细胞凋亡、坏死、滤泡结构破坏和炎细胞的浸润，而且这种损伤与碘剂量呈正相关。结论碘过量对甲状腺上皮细胞的氧化损伤作用可能是自身免疫甲状腺炎产生的必要条件。