Nodal基因的第一内含子中存在着顺式调控增强子元件

小鼠ｎｏｄａｌ基因是在胚胎发育时期表达的一个基因。它在原肠期起着重要作用，并且参与左一右体轴的决定［１，２］。４１３－ｄ小鼠胚胎于细胞系３５６３在ｎｏｄａｌ基因的第一内含子中含有单拷贝逆转录病毒的插入［３］。采用定量 ＲＮａｓｅ保护法比较了该细胞系及其母源 ＥＳ细胞 ＣＣＥ中ｎｏｄａｌ基因的表达量，ＣＣＥ细胞中ｎｏｄａｌ ｍＲＮＡ的含量是３５６３ＥＳ细胞含量的２．３倍。这一结果提示原病毒在ｎｏｄａｌ基因第一内含子中的整合降低了ｎｏｄａｌ ｍＲＮＡ的表达，其原因可能是病毒的插入破坏了ｎｏｄａｌ基因第一内含子中整合位点上的或其附近的顺式调控元件。为了验证这一推论，构建了一系列包含３５６３细胞系ｎｏｄａｌ基因的完整第一内含子及其部分片段的荧光素酶报告质粒，并以瞬时转化的方法测定了它们对报告基因转录活性的影响。该内含子５’端 ２．４ｋｂ ＤＮＡ片段亦足以使报告基因的转录活性提高 ８倍。这一结果表明：在 ｎｏｄａｌ基因的第一内含子中存在着控制ｎｏｄａｌ基因表达的顺式增强子元件。

Nodal基因顺式调控序列的分析

ｎｏｄａｌ基因是小鼠胚胎发育至原肠期在原条顶端原结处表达的一个基因。它与胚胎中胚层的形成以及左右体轴的决定有关。ｎｏｄａｌ基因的表达具有严格的时间和空间特异性。ｎｏｄａｌ基因第一内含于在基因表达调控中的研究结果表明，在第一内含子的５’侧有一个２２０ｂｐ的片段具有增强子的功能。意外的是在Ｆ９细胞中的瞬时转化试验显示：当该片段以正向克隆到基本荧光素酶报告基因上游时，它还具有启动子的活性。列出了此２２０ｂｐ的核苷酸序列，并讨论了该区域对ｎｏｄａｌ基因转录的调控作用。

Nodal基因5'末端侧翼序列增强子的分析

ＮＯｄａｌ基因属于ＴＧＦ－β超家族，它在小鼠胚胎早期发育的中胚层形成过程中起着重要 的作用。Ｎｏｄａｌ基因缺失的小鼠由于没有中胚层的形成导致死亡。分析了Ｎｏｄａｌ基因的侧翼 序列。利用荧光素酶为报告基因，构建了一系列含有侧翼序列亚克隆及其缺失体报告基因质 粒，并转化了Ｆ９细胞。分析这些亚克隆及其缺失体对报告基因活性的影响。在Ｎｏｄａｌ基因上 约－２ｋｂ处有一个增强子元件存在并鉴定了它的细胞种类特异性。

Nodal基因 5’末端侧翼序列抑制子的分析

Ｎｏｄａｌ基因属于 ＴＧＦ－β超家族。它在小鼠原肠期的原条形成过程中起重要作用。 Ｎｏｄａｌ 基因的缺失导致中胚层不能形成。使小鼠死亡。用一系列含有 Ｎｏｄａｌ基因 ５’侧翼序列其缺失 体的荧光素酶报告基因质粒瞬时转化Ｆ９细胞。通过分析这些报告基因质粒的荧光素酶活性， 在转录起始点上游的１ｋｂ处的ＥｃｏＲＩ附近找到一个抑制子元件。该抑制子元件的核心部分 位于ＥｃｏＲＩ位点下游约２００ｂｐ处，它几乎可以完全抑制Ｎｏｄａｌ基因启动子的活性。但对于 ＳＶ４０启动子没有影响。在不同的细胞种类中它的作用不同，在ＣＨＯ细胞中它具有增强活性。

Nodal基因5′末端侧翼序列启动子的分析

为了鉴定Ｎｏｄａｌ 基因的基本启动子元件，将Ｎｏｄａｌ 基因５′侧翼序列的各缺失片段构建以荧光素酶为报告基因的重组质粒。用这些携带报告基因的质粒转化Ｆ９ 细胞并测定了它们的瞬时表达荧光素酶活性。Ｎｏｄａｌ 基因的基本启动子元件位于转录起始位点上游约６０ ｂｐ，其中含有一个位于－ ３３ ｂｐ 处的ＴＡＴＡｂｏｘ，它对于转录起始起着重要作用。这个基本启动子在多种细胞类型中都有活性，但其活性不强。

Nodal基因第一内含子对nodrl基因表达的影响

Ｎｏｄａｌ基因第一内含子对ｎｏｄｒｌ基因表达的影响周迅蕾吴鹤龄（北京大学生命科学院细胞生物及遗传学系，北京１００８７１）ｎｏｄａｌ基因是小鼠胚胎发育至原肠胚期于原条顶端原结处表达的一个基因。客观存在与胚胎的中胚层的胚层的形成以及左右体轴的决定有关。ｎ...

应用CRISPR技术敲除MDA-MB-231细胞系的NODAL基因的研究

NODAL(Nodal growth differentiation factor)是一种细胞因子,为研究其功能,需建立敲除NODAL基因的细胞系。构建了两种作用于不同靶位点的CRISPR/Cas9表达载体和一种打靶载体,并通过电转法导入三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231,经嘌呤霉素抗性筛选和挑单细胞克隆,再应用PCR和测序技术鉴定基因型,以及Western Blot检测蛋白表达。将等位基因同源重组鉴定为阳性的8个单细胞克隆再经非同源重组和大片段缺失基因型鉴定,仅一个单细胞克隆的靶位点发生移码突变,4个单细胞克隆的靶位点有大片段缺失发生,4个单细胞克隆的靶位点检测到野生型等位基因。蛋白表达检测结果显示,仅有2个单细胞克隆未检测到NODAL蛋白表达,3个单细胞克隆的NODAL蛋白表达降低,另外3个单细胞克隆的NODAL蛋白表达无明显变化。最终获得了基因型和蛋白表达鉴定为敲除NODAL基因的单细胞克隆,为进一步研究NODAL在乳腺癌细胞中的分子机制奠定了基础。

Nodal与肿瘤:表达特征和功能分析

Nodal分子是胚胎发育中一个重要的形态发生素分子（Morphogen）,属于转化生长因子-β（Transforming growth factor-β, TGF-β）超家族成员.它在维持胚胎干细胞的未分化状态、诱导中胚层和形成内脏器官左右不对称性等过程中发挥重要作用[1].Nodal基因在胚胎发育早期高表达,而在胚胎晚期呈低表达,在成年正常个体中仅表达于少数几种生殖系统组织[2].最近研究表明Nodal分子在多种恶性肿瘤中表达,并与肿瘤的发生、发展、浸润和转移密切相关,说明Nodal分子可能作为肿瘤诊断的标志分子和靶向治疗的靶点.本文将综述Nodal分子的特点及其与肿瘤的关系.