lncRNA NONRATT021477.2对氧化应激条件下BRL细胞增殖和凋亡的影响

以H_(2)O_(2)诱导BRL细胞建立氧化应激型模,通过ROS和MDA试剂盒检测氧化应激的发生状态。过表达和干扰表达lncRNA 77.2后,通过流式细胞术检测细胞凋亡,CCK-8法检测细胞增殖情况。结果显示,过表达lncRNA77.2后,BRL细胞内ROS和MDA含量均极显著下降(P<0.01),细胞增殖能力增强(P<0.01),细胞凋亡率下降(P<0.01);而干扰表达lncRNA77.2后,细胞内ROS显著升高(P<0.05),MDA含量极显著升高(P<0.01),细胞增殖能力下降(P<0.01),细胞凋亡率上升(P<0.01)。结果表明,lncRNA 77.2可作为抗氧化调控因子通过抑制凋亡和氧化损伤对大鼠肝细胞起到一定的保护作用。

大鼠肝细胞系lncRNA NONRATT021477.2过表达及干扰表达条件优化

试验分别以带有目的基因的重组慢病毒质粒(pSllV-CMV-zsGreen-puro-lncRNA77.2)和3条反义核苷酸质粒转染BRL细胞,根据绿色荧光蛋白(GFP)表达情况评估转染效率;优化过表达慢病毒的最佳感染复数,并通过嘌呤霉素筛选以得到高表达稳转株。应用荧光定量PCR方法检测lncRNA NONRATT021477.2的表达量,验证过表达效果及初步确定干扰效率最高的质粒,并进一步优化ASO质粒的转染浓度和时间曲线。结果显示,重组慢病毒以感染复数(MOI)=4转染BRL细胞48 h时,lncRNA NONRATT021477.2表达量比空病毒NC组极显著升高(P<0.01),过表达效果为17倍,成功获得高表达稳转株;并且确定了干扰质粒ASO-2以250 nmol/L浓度转染BRL细胞24 h时,对靶基因水平的干扰效率最高,为78%。本试验建立了lncRNA NONRATT021477.2过表达和干扰表达质粒转染BRL细胞的最佳条件,为后续深入研究lncRNA NONRATT021477.2的生物学功能奠定基础。

下调lncRNA NONRATT021972调控TLR4对糖脂毒性诱导的胰岛β细胞炎症反应

目的关于lncRNA NONRATT021972在糖尿病中表达上调对胰岛β细胞影响的研究较少。文中旨在探讨下调lneRNA NONRAT021972调控Toll样受体4(TLR-4)对糖脂毒性诱导的胰岛β细胞炎症因子表达的影响。方法将胰岛β细胞NIT-1分成对照组(正常培养的胰岛β细胞)、模型组(用25mmol/L葡萄糖、0.25mmol/L棕榈酸的细胞培养液处理)、sh-NC组(转染shRNA control,然后用25mmol/L葡萄糖、0.25mmol/L棕榈酸处理细胞)、sh-NONRATT021972组(转染sh-NON-RATT021972,然后用25mmol/L葡萄糖、0.25mmol/L棕榈酸处理细胞)。PCR方法检测NONRATTO21972.TLR4和TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表达;CCK8实验检测细胞增殖活性变化;流式细胞术检测细胞凋亡变化;Westernblot检测C-Caspase-3.C-Caspase-9、TLR4、TNF-α、IL-6、1L-1β蛋白表达。在胰岛β细胞中分别将NONRATT021972 shRNA、阴性对照载体和NON-RATT021972 shRNA.TLR4过表达载体共转染,用含有25mmol/L葡萄糖、0.25mmol/L棕榈酸的细胞培养液处理,分为sh-NON-RATT021972+NC组(共转染NONRATT021972 shRNA和空载体,高糖高脂诱导)和sh-NONRATT021972+TLR4组(共转染NONRATT021972 shRNA和TLR4过表达载体,高糖高脂诱导)。Westerm blot检测C-Caspase-3、C-Caspase-9、TLR4,TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达。结果与对照组胰岛β细胞中NONRATTI021972表达水平(1.00±0.11)比较,模型组(2.47±0.12)明显升高(P<0.001);与sh-NC组NONRATT021972表达水平(2.45±0.23)比较,sh-NONRATT021972组(1.12±0.16)明显降低(P<0.001)。与对照组比较,模型组胰岛β细胞增殖活性降低,细胞凋亡率升高,细胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白表达及TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA和蛋白水平升高(P<0.05);与sh-NC组比较,sh-NONRATT021972组胰岛β细胞增殖活性升高,细胞凋亡率降低,细胞中C-Caspase-3.C-Caspase-9蛋白及TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA和蛋白表达降低(P<0.05)。与sh-NONRATT021972+NC组比较,sh-NONRATT021972+TLR4组胰岛β细胞增殖活性降低(P<0.05),细胞凋亡率增加(P<0.05),细胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白及TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论下调NONRATT021972通过降低TLR4的表达减少糖脂毒性诱导胰岛β细胞炎症因子表达和细胞凋亡,提高细胞增殖活性,为分子靶向治疗糖尿病提供了思路。