m5c甲基转移酶NOP2的研究进展

5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,m5c)是一种在生物体中含量丰富的RNA修饰,存在多种RNA中,可以调控细胞增殖、分化、凋亡、应激反应和其他生物学功能。在哺乳动物中,m5c甲基转移酶是RNA修饰的主要催化剂。其中,m5c甲基转移酶NOP2(NSUN1)是重要的促细胞增殖因子,在多种肿瘤的发生和发展中发挥着关键作用,同时还与数个非肿瘤疾病息息相关。本文对NOP2的生物功能以及在肿瘤和非肿瘤疾病中的研究进展作以综述。

基于生物信息学NOP2在肝癌中的预后价值研究

目的:基于生物信息学探究NOP2核仁蛋白(NOP2 nucleolar protein,NOP2)在肝癌预后中的价值。方法:采用CIBERSORT和ESTIMATE计算方法,计算497例(其中54例有癌旁组织)肝癌病人的肿瘤浸润免疫细胞(TICs)的两个主要评分。通过Cox回归分析寻找出差异表达基因(DEGs)。同时进一步收集蚌埠医学院第一附属医院行肝切除术的原发性肝癌病人10对癌组织及相邻癌旁组织进行qRT-PCR分析。结果:NOP2的表达水平与肝癌的病理特征(较晚的M分期)呈正相关,与病人的生存时间呈负相关。通过基因集富集分析(GSEA)发现NOP2高表达的基因主要富集于与免疫相关通路。进一步研究证实6种免疫细胞与NOP2表达呈正相关,包括M0巨噬细胞、静止期自然杀伤细胞、激活期CD4^(+)记忆T细胞、CD8^(+)T细胞、滤泡辅助性T细胞、调节性T细胞。5种免疫细胞与NOP2的表达水平呈负相关,包括记忆B细胞、嗜酸性粒细胞、M2巨噬细胞、单核细胞、休止期CD4^(+)记忆T细胞。且qRT-PCR显示NOP2在肝癌中呈高表达,在癌旁呈低表达。结论:NOP2在肝癌中呈高表达,且与生存时间成负相关,其表达水平可有助于预测肝癌病人的预后,尤其是对于肿瘤微环境中免疫相关细胞的影响。

NOL1/NOP2/Sun RNA甲基转移酶家族成员2在肾脏缺血再灌注损伤中的作用

目的构建肾脏缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)小鼠及细胞模型,观察NOL1/NOP2/Sun RNA甲基转移酶家族成员2(NOL1/NOP2/Sun domain family member 2,Nsun2)表达变化,探讨Nsun2在肾脏IRI中的作用。方法雄性C57BL/6N小鼠12只,随机分为IRI-3组、IRI-6组、IRI-24组和假手术组各3只。使用无损伤显微血管夹夹闭小鼠肾蒂使肾脏缺血30 min,随后移除血管夹恢复肾脏血流,IRI-3组、IRI-6组、IRI-24组分别再灌注3、6、24 h;假手术组仅做手术切口和缝合,不做其他处理。IRI-3组、IRI-6组和IRI-24组小鼠分别于再灌注3、6、24 h时,假手术组小鼠于再灌注24 h时检测血肌酐水平。取血后处死小鼠取左肾组织,行HE染色检测4组肾脏组织病理变化,行免疫荧光染色检测IRI-24组和假手术组肾脏组织Nsun2表达,采用Western blot法检测4组肾脏组织Nsun2、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)相对表达量。取人近端肾小管上皮HK-2细胞,分别应用0、100、200μmol/L CoCl_(2)处理24 h后更换正常培养基继续培养2 h,采用Western blot法检测Nsun2、Bax、Bcl-2蛋白相对表达量,确定构建IRI细胞模型的CoCl_(2)处理最适宜浓度为200μmol/L。取HK-2细胞分为siRNA-NC组、siRNA-Nsun2组,分别转染2.5μL 20μmol/L的siRNA-NC和2.5μL 20μmol/L的siRNA-Nsun2,转染6 h后培养24 h,采用Western blot法检测2组细胞Nsun2蛋白相对表达量。取siRNA-NC组、siRNA-Nsun2组细胞,应用200μmol/L CoCl_(2)处理24 h后培养2 h,分别为siRNA-NC+IRI组和siRNA-Nsun2+IRI组,采用Western blot法检测siRNA-NC组、siRNA-NC+IRI组、siRNA-Nsun2+IRI组细胞Bcl-2、Bax蛋白相对表达量,采用流式细胞术检测细胞凋亡率。结果IRI-3、IRI-6、IRI-24组血肌酐水平[(44.44±2.96)、(49.91±5.65)、(56.41±5.13)μmol/L]均高于假手术组[(27.35±2.96)μmol/L](P<0.05),IRI-24组高于IRI-3组(P<0.05)。假手术组肾小球及间质细胞正常,肾小管上皮细胞结构完整,IRI-3组、IRI-6组、IRI-24组肾小球及间质细胞正常,肾小管上皮细胞出现空泡和颗粒化变性、崩解以及管腔堵塞,且24 h内再灌注时间越长,病理改变越重。免疫荧光染色结果显示,Nsun2定位于细胞核,呈点状分布;IRI-24组近端肾小管上皮细胞Nsun2表达明显多于假手术组。IRI-24组肾脏组织Nsun2蛋白相对表达量(0.33±0.03)高于假手术组、IRI-3组、IRI-6组(0.17±0.01、0.22±0.05、0.25±0.01)(P<0.05),IRI-6组高于假手术组(P<0.05);IRI-3组、IRI-6组、IRI-24组肾脏组织Bax蛋白相对表达量(0.52±0.04、0.54±0.06、0.44±0.04)均高于假手术组(0.14±0.01)(P<0.05),IRI-3组、IRI-6组均高于IRI-24组(P<0.05);IRI-6组、IRI-24组肾脏组织Bcl-2蛋白相对表达量(0.17±0.08、0.03±0.02)均低于假手术组、IRI-3组(0.39±0.13、0.34±0.07)(P<0.05)。200μmol/L CoCl_(2)组细胞Nsun2、Bax蛋白相对表达量(0.53±0.04、0.66±0.04)均高于0μmol/L CoCl_(2)组(0.31±0.02、0.28±0.01)和100μmol/L CoCl_(2)组(0.34±0.02、0.52±0.04)(P<0.05),Bcl-2蛋白相对表达量(0.24±0.01)均低于0μmol/L CoCl_(2)组和100μmol/L CoCl_(2)组(0.56±0.02、0.37±0.01)(P<0.05);100μmol/L CoCl_(2)组细胞Bax蛋白相对表达量高于0μmol/L CoCl_(2)组(P<0.05),Bcl-2蛋白相对表达量低于0μmol/L CoCl_(2)组(P<0.05)。siRNA-Nsun2组细胞Nsun2蛋白相对表达量(0.33±0.02)低于siRNA-NC组(0.64±0.07)(P<0.05)。siRNA-NC+IRI组细胞Bax蛋白相对表达量(0.61±0.03)及细胞凋亡率[(8.63±1.00)%]均高于siRNA-NC组[0.48±0.02、(1.93±0.55)%](P<0.05),Bcl-2蛋白相对表达量(0.44±0.05)低于siRNA-NC组(0.79±0.02)(P<0.05);siRNA-Nsun2+IRI组细胞Bax蛋白相对表达量(0.32±0.02)及细胞凋亡率[(5.33±1.12)%]均低于siRNA-NC+IRI组(P<0.05),Bcl-2蛋白相对表达量(0.63±0.03)高于siRNA-NC+IRI组(P<0.05)。结论IRI小鼠肾脏组织及IRI肾小管上皮细胞HK-2中Nsun2表达上调,下调Nsun2表达可抑制IRI肾小管上皮细胞凋亡。

顺铂处理的肺癌细胞NSUN 2 mRNA剪接异构体变化

目的:探讨顺铂(CDDP)处理肺癌细胞后NSUN 2 pre-mRNA的剪接变化。方法:在NSUN 2基因的pre-mRNA有选择性剪接的外显子两侧的外显子上设计检测引物,选取16例非小细胞肺癌患者的肿瘤组织及其癌旁正常组织,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测组织NSUN 2各mRNA剪接异构体的表达;取人肺癌细胞系A549细胞和H1299细胞分别用不同浓度CDDP处理,A549细胞分为0、8、16、24、32、40、48及56μmol/L组,H1299细胞分为0、12、24、36、48、60、72及84μmol/L组,采用RT-PCR检测各组细胞NSUN 2各mRNA剪接异构体的表达;RT-PCR产物胶回收后进行TA克隆测序并与NCBI网站数据库中NSUN 2的序列进行比对分析。结果:人肺癌细胞系A549细胞和H1299细胞及肺癌临床样本中NSUN 2基因可编码蛋白的mRNA剪接异构体表达量最高,占主导地位;随着CDDP浓度增加,NSUN 2可编码蛋白的异构体在H1299细胞的高浓度组中的表达下降(P<0.01),非编码蛋白的异构体在A549细胞和H1299细胞的高浓度组中表达均上升(P<0.05);检测到2种未见报道的mRNA剪接异构体。结论:CDDP处理后肺癌细胞中NSUN 2 pre-mRNA剪接会发生变化,NSUN 2基因的表达存在pre-mRNA选择性剪接调控。

干扰NSUN2通过调控细胞周期蛋白表达抑制黑素瘤细胞增殖

为探讨太阳结构域家族蛋白酶2(NOP2/Sun RNA methyltransferase 2,Nsun2)RNA甲基化酶在黑素瘤细胞中的生物学功能,本研究以小鼠黑素瘤B16细胞为对象,构建靶向干扰Nsun2基因的shRNA慢病毒干扰载体,包装病毒后感染B16细胞。与对照组相比,干扰组细胞中Nsun2的敲低效率达到80%。EdU染色结果表明,干扰Nsun2显著抑制B16细胞DNA合成能力。转录物组测序技术系统分析干扰组与对照组细胞基因表达水平,共筛选获得1062个差异表达基因(DEGs),其中678个表达上调,384个表达下调。DEGs主要富集在染色体、着丝粒区、蛋白质结合等GO条目。KEGG分析表明,DEGs显著富集在细胞周期、DNA复制、细胞衰老等通路。荧光定量PCR和转录物组测序结果均发现,Cdk2、Ccna2、Cdc25b等促进细胞分裂的相关基因显著下调,而Gadd45g和Gadd45a等阻滞细胞增殖的基因显著上调。本研究表明,NSUN2通过调控细胞周期和DNA复制等生物学过程,影响黑素瘤细胞增殖,为黑素瘤发生和发展的分子机制研究提供参考。

NSUN2对肾嫌色细胞癌患者预后的影响及潜在机制探讨

目的:通过多种生物信息学相关工具,对甲基转移酶NSUN2(NOP2/Sun RNA methyltransferase 2)基因及蛋白的理化性质和分子结构等方面进行预测,结合对TCGA数据库的挖掘分析,为进一步研究NSUN2在肾嫌色细胞癌(Kidney Chromophobe,KICH)中的功能和作用机制提供思路。方法:利用ProtParam、Protscale、STRING等数据库或软件对NSUN2的分子结构、相互作用蛋白等作出预测和分析,通过TIMER2.0和Sangerbox3.0对TCGA数据库进行挖掘。结果:NSUN2蛋白是一种不稳定的亲水性蛋白质,不含信号肽结构,并且主要分布在细胞核内,在机体内主要作为甲基转移酶参与RNA的修饰和装配。NSUN2在KICH组织中的表达显著高于正常肾组织,并且KICH的高表达可能与KICH不良预后显著相关。此外NSUN2也与KICH的免疫存在相关。结论:利用生物信息学方法系统分析和预测,对NSUN2有了更为深入的了解,为进一步探讨NSUN2在KICH中的功能和作用机制提供了新的线索。