沉默NF-κB/p65对TNF-α诱导的肺泡Ⅱ型上皮NOX1基因表达的影响

目的构建急性肺损伤肺泡Ⅱ型上皮A549细胞炎症模型,通过沉默NF-κB基因,观察NOX1基因表达水平及氧化应激指标变化,探讨NOX1基因与NF-κB/p65的相关性。方法运用RNA干扰技术沉默NF-κB/p65基因,以TNF-α(10 ng/ml)刺激肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549),采用RT-PCR及Western blot检测NOX1基因表达水平,DCFH-DA探针法检测细胞内活性氧水平,比色法检测细胞的总抗氧化能力、总谷胱甘肽、总超氧化物歧化酶活力和丙二醛的浓度。结果采用TNF-α刺激肺泡Ⅱ型上皮A549细胞可以分别在基因和蛋白水平上调NOX1基因表达;同时,增加细胞丙二醛和活性氧浓度,降低总抗氧化能力、总谷胱甘肽及超氧化物歧化酶浓度,氧化应激程度放大(P<0.05)。预转染NF-κB/p65 siRNA,可下调NOX1基因的表达,减少细胞丙二醛、活性氧生成,提高总抗氧化能力、总谷胱甘肽及超氧化物歧化酶浓度,氧化应激程度降低(P<0.05)。结论沉默NF-κB/p65基因,可有效下调TNF-α诱导A549细胞氧化应激程度及NOX1基因表达水平,提示NF-κB/p65可能参与调控TNF-α诱导的NOX1基因表达。

猪NOX1基因启动子区转录因子的筛选与鉴定

为了寻找调控猪NADPH氧化酶1(NOX1)基因转录的转录因子,本研究采用3′端固定,5′端逐渐截短的方法,扩增了NOX1基因的启动子区序列,并将它们分别连入双荧光素酶报告基因载体,转染PK15细胞后,检测双荧光素酶的相对活性。根据活性高低判定转录因子可能结合的位置,利用重叠PCR技术定点缺失转录因子的结合序列,再次连入报告载体后,根据荧光素酶活性的变化判定是否为NOX1基因真正的转录调控因子。结果发现,NOX1基因启动子区的-1618~-1 bp区间存在转录调控因子的结合位点,对该区间开展2轮截短试验后,初步判定-1149~-1091 bp和-208~-115 bp区间存在正调控元件,-1091~-1052 bp区间存在负调控元件。针对上述3个区间,同时结合在线软件的预测结果,定向缺失了-1104~-1092 bp,-1051~-1043 bp,-1043~-1033 bp和-126~-116 bp小片段后,确定-1104~-1092 bp和-126~-116 bp区间存在正调控该基因转录的元件结合位点,分别为ZNF384、ELF-1和TBR1。本研究克隆了猪NOX1基因的启动子序列,对可能结合到该区间的转录因子进行了筛选与分析,为后续分析NOX1的转录调控机制,探讨其生物学功能奠定了基础。