新城疫病毒V4株NP和P基因及其间隔区序列的克隆与分析

采用RT-PCR技术克隆了新城疫病毒(NDV)V4株长约4 200 bp的核苷酸序列,并进行了序列测定与分析。结果表明,该序列中包含有NDV V4株NP基因编码区、NP和P基因间隔区以及P基因的全部核苷酸序列。NDV V4株NP和P基因与其他8个NDV毒株相应部分进行同源性比较,与Quuesland V4株的同源性最高。NDV V4株NP和P基因间隔区序列与其他13株NDV毒株相应部分的比较结果表明,F48E9等强毒株较La sota等弱毒、无毒毒株和试验用V4株在这个区域多了6个碱基,这6个碱基插入的位置在La sota等弱毒、无毒毒株全基因组序列的1647-1648 nt处;参比的14株NDV在这个区域的同源性为63．9％-100％,弱毒株之间的同源性较高,弱毒株与强毒株之间及强毒株之间的同源性差异较大。

马铃薯卷叶病毒(PLRV)内蒙古分离物基因间隔区(IS)的克隆与序列分析

根据Genbank已报道马铃薯卷叶病毒(PLRV)基因组序列,分析其基因间隔区(IS)两端的保守区,自行设计、合成一对特异性引物,以PLRV内蒙古分离物总RNA为模板,经RT-PCR扩增得到含PLRVIS的一段369 bp的cDNA,克隆于载体pBS-T中。重组质粒经PCR鉴定、酶切分析和核苷酸序列测定,并进一步与PLRV其他分离物的同源序列作比对。结果表明:克隆的PLRV内蒙古分离物的IS序列与其他全部已发表的13个全基因组中的IS核苷酸序列有很高的同源性,最高达到100%,平均为97.90%,高于这13个PLRV全基因组序列96.81%的同源性,说明IS序列不仅在PLRV的不同株系间比较保守,而且在PLRV的全基因组序列中也是相对保守的。研究结果预示,将IS构建成RNA干扰型结构导入马铃薯,将有可能获得抗PLRV多种株系且抗性更高的转基因植株。

日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30重链可变区基因的体外扩增克隆及序列分析

目的 分离日本血吸虫单克隆抗独特型抗体 NP30重链可变区 (VH)基因并测定其序列。方法 根据鼠免疫球蛋白重链可变区基因 FR1和 FR4序列的保守性 ,化学合成体外扩增 Ig重链可变区基因的数对引物。以日本血吸虫单克隆抗独特型抗体 NP30的杂交瘤细胞株基因组 DNA为模板 ,扩增 VH 基因 ,将其克隆入 p U C19载体 ,重组子用 Sanger's双脱氧链终止法测定序列 ,将序列与Gene Bank中已发表的抗体序列比较。结果 VH 基因全长 35 7bp,属鼠免疫球蛋白重链第 亚类 ,由种系基因 V、Dsp2 .8与 JH4重排而来。该 VH 基因序列已被 Gene Bank收录 (accession NoAF2 82 6 2 2 )。结论 该 VH 基因为日本血吸虫单克隆抗独特型抗体

坛紫菜rbcS及rbcL-rbcS基因间隔区的序列分析

Rubisco是光合作用和光呼吸的关键酶,目前已成为高等植物中研究最深入的酶之一,而在低等藻类中关于该酶的相关研究却很少。以来自浙江和福建的6个坛紫菜(Porphyra haitanensis)无性系为研究对象,以江苏条斑紫菜(P.yezoensis)为参照,克隆了其Rubisco小亚基(rbcS)及大小亚基基因间隔区共516 bp的序列。序列分析结果表明,其中4个坛紫菜系(Hza、Hzf、Hpt、Hzz)的基因序列完全相同(以其作为标准),坛紫菜Hzb和Hzc与其均只有1个碱基差异,而条斑紫菜Yn55与其差别碱基为46个。将本实验的7条紫菜序列与GenBank数据库收录的17条紫菜Rubisco序列一起做系统分析,结果表明坛紫菜和条斑紫菜都分别归到了各自的类群中。以上结果说明,紫菜rbcS和rbcL-rbcS基因间隔区序列的同源性较高,可用于种以上水平的系统分析。

桑树TrnL-trnF基因间隔区序列的特点及分析

设计桑树TrnL trnF基因间隔区序列的特异引物 ,扩增并分析了桑属育 71 1和桑莲 2个品种的TrnL trnF基因间隔区序列 ,其长度分别为 4 14bp和 4 17bp ,且富含A/T。该序列有 4 2 1个分析性状 ,具有 17个变异位点。在这些变异中主要以碱基的插入和缺失 (主要是插入 /缺失dA)为进化形式 ,其余的发生了少数置换。除这些变异位点以外的核苷酸序列完全相同 ,说明两者有高度同源性 ,与桑科、菊科和蔷薇科的TrnL trnF基因间隔区序列有一定同源性。用Clustalx软件对 2 1份材料的TrnL trnF基因间隔区序列进行聚类分析 。

水稻条纹病毒RNA4基因间隔区序列分析——混合侵染及基因组变异证据

克隆和测定了我国水稻条纹病毒 (RSV) 2 2个分离物RNA4基因间隔区 (Intergenicre gion,IR)序列 ,序列比较结果表明 ,我国RSVRNA4IR在长度上存在 63 4bp、65 4bp及 73 2bp 3种不同的类型 ,其中 3种不同类型的序列在云南省均有存在 ,而在其它省份仅存在 65 4bp类型的序列 ,云南省还存在不同片段类型序列在同一分离物中混合侵染的现象。序列内部具有两个重要的结构特征 ,一是具有插入序列 ;二是有两处反向重复序列 ,可形成两个明显的发夹结构 ,其中一个序列比较保守 ,形成的发夹结构稳定 ;但另一个发夹结构由于碱基变异导致其稳定性在各个分离物中差异较大。本论文还讨论了插入片段特性。

rRNA基因间隔区序列用于亲缘关系密切的根瘤菌种群鉴定及系统发育分析

通过rRNA基因内转录间隔区的碱基序列分析,对中华根瘤菌属Sinorhizobium、慢生根瘤菌属Bradyrhizobium和中慢生根瘤菌属Mesorhizobium种间亲缘关系十分密切的菌株进行区分.结果表明,rRNA基因间隔区序列能很好地区分种间亲缘关系十分密切的菌株.用rRNA基因间隔区序列构建的系统发育树与rRNA基因序列构建的系统发育树结果十分相似.

马铃薯卷叶病毒基因间隔区的克隆及序列分析

根据已报道的马铃薯卷叶病毒基因组序列．设计合成一对特异性引物，以马铃薯卷叶病毒中国分离株（ＰＬＲＶ－Ｃｈ）的ＲＮＡ为模板，反转录合成ｃＤＮＡ第一条链，经ＰＣＲ扩增后克隆于ｐＵＣ１９质粒中，进一步用ＰＣＲ鉴定、限制酶切分析和序列分析，结果表明：ＰＬＲＶ－Ｃｈ基因间隔区由１９７个核苷酸组成，与国外报道的荷兰ＰＬＲＶ－Ｎ加拿大ＰＬＲＶ－Ｃ，澳大利亚ＰＬＲＶ－Ａ，苏格兰ＰＬＲＶ－Ｓ各株系核苷酸序列具有很高的同源性，同源率依次为９９％、９８％、９３％、９８％。

赤潮铜绿微囊藻rDNA基因间隔区的序列分析以及与淡水微囊藻的比较

采用ＰＣＲ及序列测定的方法，对在厦门西港海域采集的赤潮铜绿微囊藻１６Ｓ和 ２３５ｒＤＮＡ基因间隔区Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ Ｓｐａｃｅｒ Ｒｅｇｉｏｎ （ＩＳＲ）区进行了序列测定和分析，并通过与两 种淡水微囊藻的比较，找出了其特征性核苷酸作为专一性分子探针设计的靶序列，为该藻 种以及微囊藻属的快速鉴定及系统学研究提供了分子基础。

基于16SrRNA和16S-23SrRNA基因间隔区序列探讨陆生和水生螺原体菌株的系统发生关系

采集江苏省养殖池塘内发病的中华绒螯蟹、克氏原螯虾和南美白对虾,利用已有螺原体16S rRNA和23S rRNA基因序列保守引物扩增并测序16S rRNA和16S-23S rRNA基因间隔区序列(ISRs).基于已获得的序列和GenBank中下载的螺原体序列分别进行同源性比对,比对的结果分别利用PAUP软件和MrBayes软件提供的最大似然法和贝叶斯法进行系统发生关系分析.分析结果是:所有淡水甲壳动物螺原体菌株Spiroplasma erio-cheiris(中华绒螯蟹)、Spiroplasmasp.CRAYFISH(克氏原螯虾)、Spiroplasmasp.SHRIMP(南美白对虾)严格聚为一支,并且与陆生兔扁虱螺原体(非凡螺原体)Spiroplasma mirum关系最近,而与中国报道的陆生植物螺原体菌株Spiroplasmasp.CR-1(油菜)、Spiroplasmasp.CNR-1(油菜)、Spiroplasmasp.CNR-2(油菜)、Spiroplasmasp.CAN-1(杜鹃花)、Spiroplasmasp.CRW-1(红花酢浆草)及昆虫螺原体菌株Spiroplasmasp.CH-1(蜜蜂)、Spiroplas-masp.M10(蜜蜂)关系较远,此外,3个淡水甲壳动物螺原体菌株与现今唯一报道的海水南美白对虾螺原体Spi-roplasma penaei系统发生关系也很远.因此,在螺原体属中,我国发现的淡水甲壳动物螺原体近缘种是非凡螺原体而不是我国陆生昆虫或植物螺原体及美洲的南美白对虾螺原体.

红豆杉科及相关类群叶绿体rbcL基因与trnL-trnF间隔区序列的分支分析

运用对PCR产物克隆后测序和对PCR产物直接测序的方法对红豆杉科、三尖杉科和罗汉松科 16种植物的叶绿体rbcL基因和trnL -trnF基因间隔区序列进行了测定。选用PAUP软件分别对rbcL基因、trnL_trnF间隔区和rbcL基因—trnL_trnF间隔区联合数据矩阵进行分支分析 ,结果显示 :①穗花杉属以置于红豆杉科内为宜 ,将穗花杉属独立成科的意见未得到支持 ;②三尖杉属内篦子三尖杉地位特殊 ,赞同成立篦子三尖杉组 ;③罗汉松科属单系群 ,竹柏类应归属罗汉松科 ,不同意将其从该科中分离出来成立新科竹柏科 ;④不支持红豆杉科独立成目 ,其单生单轴球果可能是由复合双轴球果减化而来。

花椒cpDNA trnL-F间隔区序列的特征及其在混淆品鉴别中的应用

目的 :通过分析花椒cpDNAtrnL -F间隔区序列特点 ,探讨该序列在花椒与其混淆品鉴别中的意义。方法 :对花椒及其混淆品进行cpDNAtrnL -F间隔区序列比较研究。结果 :花椒cpDNAtrnL -F间隔区序列为 349bp、AT百分比为 6 2 .1%。尽管花椒的果实在外部形态 ,物理特性上与混淆品差异较小 ,但在cpDNAtrnL -F间隔区序列上却存在着显著而稳定的差异。该序列在属以下的分类阶元中同源性极高 ,可达 10 0 %。结论 :根据cpDNAtrnL-F间隔区碱基序列的差异 。

山丘疫区杜氏利什曼原虫核糖体基因内转录间隔区的克隆及序列分析

目的 构建我国山丘疫区杜氏利什曼原虫分离株前鞭体核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区 (ITS)片段克隆 ,并进行测序及同源性分析。 方法 提取杜氏利什曼原虫前鞭毛体DNA进行PCR扩增 ,将扩增出rDNAITS片段克隆入pMD18 Tvector上 ,双脱氧链末端终止法测序。 结果 扩增出约 10 0 0bp的rDNAITS片段。测序结果表明山丘疫区的2株利什曼原虫L .d .SC10和L .d .6分别为 10 2 7bp和 10 2 8bp。序列分析结果表明 ,L .d .SC10和L .d .6有一定差异。 结论 获得了我国山丘疫区杜氏利什曼原虫分离株L .d .SC10和L .d .6的前鞭体rDNAITS序列。

水稻条纹病毒两个分离物RNA4基因间隔区的序列比较

通过RT PCR扩增了我国水稻条纹病毒 (RSV)山东济宁 (JN)、云南宜良 (YL)两个分离物RNA4基因间隔区 (intergenicregion ,IR)序列 ,并克隆于 pGEM Teasy载体上。序列分析结果表明 :JN、YL两分离物RNA4IR均由 6 5 4个核苷酸组成 ,两者之间的同源率为 92 %。JN、YL两个分离物RNA4IR在AU碱基富集处可形成两个明显的发夹结构 ,其中一个序列比较保守 ,形成的发夹结构稳定 ;但另一个由于碱基变异导致所形成的发夹结构的稳定性在各个分离物中差异较大。

口蹄疫病毒非结构蛋白P3区的基因序列及分析

以口蹄疫Akesu/ 5 8分离株的 5 3代牛舌皮病料为材料 ,采用RT PCR法 ,扩增和克隆了两个约 1.5kb的DNA片段。核酸序列测得结果对接后 ,涵盖了全部P3区的基因序列。口蹄疫Akesu/ 5 8分离株基因组P3区的核酸序列共计 2 ,72 4nt,包括一个终止密码子TAA ,共编码 90 7个氨基酸 ;其中非结构蛋白 3A的基因是 45 9nt,编码 15 3个氨基酸 ;3个 3B(VPg)基因分别是 6 9、72和 72nt,氨基酸分别为 2 3、2 4和 2 4;3C是 6 39nt,2 13个氨基酸 ;3D是1,413nt ,471个氨基酸。各蛋白间由Glu/Gly(Ser)连接。序列比较显示 :3A的C端易变 。

新城疫病毒长春株NP、P、M蛋白基因的克隆与序列分析

参考新城疫病毒 (NDV)相关毒株基因组核苷酸序列 ,设计了 3对特异性引物 ,应用 RT- PCR一次性扩增出NDV长春株 NP、P、M基因的氨基酸编码区 (ORF)。将 NP、P、M基因插入质粒 p Bluescript KS(- )后测序。序列分析表明 ,长春株 NP、P、M基因的 ORF长度分别为 1470、1188、10 95 bp,分别编码 490、396、36 5个氨基酸 ,与发表的13株 NDV毒株相关基因相比较 ,核苷酸序列同源性分别为 85 .7%～ 99.1%、82 .8%～ 96 .9%、84.3%～ 99.7% ,推导的氨基酸序列同源性分别为 92 .5 %～ 99.3%、84.3%～ 95 .9%、88.9%～ 99.1%。对 NP、P、M基因同源性比较和进化树分析结果表明 ,长春株与 L a Sota、B1等弱毒株之间具有很近的亲缘关系 。

广西莱姆病螺旋体5s-23srRNA间隔区基因的克隆和序列分析

目的对广西莱姆病螺旋体分离株基因型鉴定。方法应用聚合酶链反应从3株广西莱姆病螺旋体及1株贵州分离株全基因组DNA中将5S -23SrRNA间隔区基因调出 ,并克隆至质粒PGEM -T中 ,构建重组质粒 ,测序后与国外其它分离株进行同源性比较。结果4株莱姆病螺旋体均扩增出约242bp的5s-23srRNA间隔区基因 ,同源性99%以上,与B.valaisiana基因型的同源性均比其他基因型高 ,同源性97.1 %～97.9 %。结论4株莱姆病螺旋体均属于B.valaisiana基因型 。

广西陆川猪猪肺炎支原体P97基因R1区克隆及序列分析

本试验通过深入了解广西陆川猪猪肺炎支原体（Mhp）地方流行毒株的黏附因子P97基因R1区的序列特征、基本结构及遗传变异等特点,为广西地方品种陆川猪猪支原体肺炎（MPS）有效的综合防控措施提供理论依据,并为进一步研究广西陆川猪Mhp地方流行毒株特性打下坚实的基础。参考Mhp基因组序列设计扩增P97基因R1区的1对引物,以2011年—2014年广西陆川猪MPS阳性病料为研究对象,提取基因组DNA,PCR扩增P97基因R1区,对PCR产物进行测序,将广西陆川猪Mhp不同地方流行毒株的P97基因R1区序列的碱基组成和推导的氨基酸序列进行比对。DNAStar软件分析结果表明,所获得的15株广西陆川猪Mhp毒株（GXLC-1、GXLC-2、GXLC-3、GXLC-4、GXLC-5、GXLC-6、GXLC-7、GXLC-8、GXLC-9、GXLC-10、GXLC-11、GXLC-12、GXLC-13、GXLC-14、GXLC-15）和3株广西其他品种猪Mhp毒株（GX227、GX595、GX674）的P97基因R1区的多处碱基发生变异。通过推导氨基酸序列统计P97R1区五氨基酸（AAKPV/E）重复数为9~18,平均值为12,TN重复数为1~4,结果发现广西陆川猪Mhp流行毒株变异使其毒力和黏附能力增强,再加上陆川猪呼吸道短小狭窄的特殊结构,更易导致广西陆川猪MPS的发生。

红豆杉科及相关类群叶绿体rbcL基因与trnL—trnF间隔区序列的分支分析

运用对PCR产物克隆后测序和对PCR产物直接测序的方法对红豆杉科、三尖杉科和罗汉松科16种植物的叶绿体rbcL基因和tmL-trnK基因间隔区序列进行了测定。运用PAUP软件分析对rbcL基因、trnL-trnK间隔区和rbcL基因-trnL-trnK间隔区联合数据矩阵进行分支分析,结果显示:(1)稳花杉属以置于红豆杉科内为宜,将穗花杉属独立成科的意见未得到到支持;(2)三尖杉属内篦子三尖杉的地位特殊,赞同成立篦子三尖杉组;(3)罗汉松科属单系群,竹柏类应归属罗汉松科,不同意将其从该科中分离出来成立新科—竹柏科;(4)不支持红豆杉科独立成目,其单生单轴球果可能是由复合双轴球果减化而来。

陕西省番茄黄化曲叶病毒基因间隔区缺失突变体的鉴定与不同分离物间群体进化研究

为明确番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)基因组的变异情况,分别从陕西省杨凌区、泾阳县、大荔县和阎良区采集了表现为番茄黄化曲叶病症状的抗病品种番茄样品20份以及感病品种番茄样品4份。经TYLCV特异性引物检测,24个样品均为阳性。通过全长扩增测序获得了15个TYLCV分离物的基因组序列。序列分析显示,其中7个分离物基因组大小为正常的2781 bp,而有8个TYLCV分离物基因组大小为2768 bp。与正常基因组相比,这8个分离物在基因间隔区(intergenic region,IR)的TATA-box与保守9核苷酸序列之间发生了13个核苷酸的缺失。对我国不同地区TYLCV分离物全基因组序列进行变异分析,发现IR区域是发生核苷酸变异最大的区域。系统进化分析表明,本研究分离到的15个TYLCV分离物均属于TYLCV-Israel进化分支下的中国亚群,其中8个TYLCV IR缺失突变体与国内已报道的IR缺失突变体BJ04和BJ06亲缘关系较远,而与本研究中分离得到的正常TYLCV分离物亲缘关系最近,疑似为陕西地区出现的一类新TYLCV IR缺失突变体。本研究首次对我国不同地区多个TYLCV分离物出现IR区缺失现象进行了报道。