内含埃博拉病毒NP基因序列假病毒粒子的构建及应用

目的:构建内含埃博拉病毒(EBOV) NP基因序列的假病毒粒子,建立EBOV Taqman实时荧光定量PCR检测方法。方法:对埃博拉病毒的NP基因序列进行分析,分析基因是否包含重复序列,复杂二级结构以及高GC含量等;根据序列分析结果,合成NP全基因序列,并将NP基因的序列克隆至慢病毒包装载体pGWLV-pseudovirus中,转化DH5α感受态细胞,筛选得到阳性克隆pGWLV-NP质粒。将重组质粒转染293T 细胞,培养48 h后进行除菌,纯化后获得高纯度假病毒,通过RT-PCR鉴定该假病毒粒子含有EBOV NP基因。通过荧光定量qPCR对假病毒颗粒进行计数后,利用本研究所获得的假病毒颗粒制备用于EBOV核酸检测的标准品。结果:建立了基于EBOV NP基因的Taqman荧光定量PCR检测方法。本研究建立的基于包含NP基因的EBOV假病毒核酸cDNA的Taqman荧光定量PCR检测方法的Ct值与核酸cDNA标准品1 × 109~1 × 101个/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数可达到0.99。结论:该方法所用标准品模拟了真实病毒粒子的结构,无生物传染性,经检测均匀性和稳定性良好,可作为EBOV核酸检测的阳性标准质控品,实现对核酸检测的全程监控。

新城疫病毒F48E9株M和NP基因的原核表达

根据新城疫病毒(NDV)F48E9国内标准强毒株编码序列设计了2对特异性引物,分别用于扩增M和NP基因。经序列测定,将其克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,转化E.coliBL21(DE3),筛选表达NDV F48E9株M蛋白和NP蛋白的菌株。IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析结果表明,NDV M蛋白在E.coliBL21(DE3)内以可溶形式存在,而NP蛋白以包涵体的形式表达。用纯化的M和NP蛋白免疫鸡制备超免疫血清,进行Western-blot分析;结果,它们可以与真核表达系统表达的M和NP蛋白以及NDV发生特异性反应,表明,原核表达系统表达的NDV M和NP蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。

猪流感病毒NP基因的克隆及杆状病毒转移载体的构建

本研究通过RT-PCR扩增了猪流感病毒A/Swine/Inner Mongolia/547/01(H3N2)的NP基因,并将其克隆入pMD18-T载体。重组pMD18-T经SalI和EcoR I酶切后得到的NP基因插入pMelBacB载体的SalI/EcoRI位点。PCR和限制性内切酶分析鉴定表明成功构建了pMelBacB-NP转移载体。这为开发NP诊断抗原和亚单位疫苗奠定了基础。

鸭源新城疫病毒NP基因在昆虫细胞中的表达及抗原性检测

为在昆虫细胞中表达鸭源新城疫病毒NP蛋白质,首先根据鸭源新城疫病毒NP基因序列设计引物,扩增出NP基因,将其克隆至杆状病毒表达载体p Fast Bac1,获得重组转移载体p Fast Bac-NP,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒r Bacmid-NP,在脂质体的介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒NP蛋白质。Western blot、间接免疫荧光试验结果均显示表达的重组蛋白质能够与全病毒阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。以上结果说明鸭源新城疫病毒NP蛋白质在昆虫细胞中获得了成功表达。

应用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法检测人工感染雏鸭体内DEV NP基因表达水平

为阐明DEV的感染与致病机理,更深入地研究病原与鸭体的相互关系。将鸭肠炎病毒(DEV)强毒GZ株经腿部肌肉注射感染15日龄雏鸭后,应用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法对NP(病毒核衣壳蛋白)基因转录物进行定量,以检测NP基因在雏鸭体内各组织的表达水平。结果显示:NP基因在所检组织中均有表达,感染后3 h即可在肝、脾、脑、胸腺、肾和肺6种组织中检测到NP基因的表达;感染后6 h,除上述组织外还可在十二指肠和盲肠检测出;感染后10 h又可在胸肌和心肌等检测出。不同受检组织检出量有所不同,且在感染后30或48 h达到高峰,持续至96 h,之后均有所下降。

两株A型禽流感病毒NP基因的PCR扩增及序列分析

研究选择 AIV NP基因为目的基因 ,设计了一对特异性引物 ,筛选出最佳的 RT-PCR扩增条件 ,特异性地扩增出了两株 A型禽流感病毒的部分 NP基因片段 ,并对其进行了序列分析 ,结果表明 ,两株来源于不同禽类的 AIV的NP基因同源率高达 92 %。AIV

4株不同亚型流感病毒NP基因的原核表达

为了进一步研究A型流感病毒核蛋白功能及在诊断中的应用,采用RT-PCR技术分别扩增H1N1、H3N2、H5N1、H9N2等4株不同亚型流感病毒的NP基因,分别将其克隆到原核表达载体pET30(a)上,在大肠埃希菌中进行诱导表达。SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,H1N1亚型流感病毒NP蛋白得到表达,并且能分别与H1N1和H5N1亚型流感病毒的鼠高免血清发生特异性反应,具有良好的反应活性;而H3N2、H5N1、H9N2亚型流感病毒的重组NP蛋白未获得表达。本研究结果表明,不同毒株的NP蛋白在大肠埃希菌中的表达具有一定差异性,为把NP蛋白作为诊断抗原的开发、ELISA诊断方法的建立以及蛋白功能的研究奠定了基础。

猪流感H1N1亚型NP基因杆状病毒表达载体构建及其在昆虫细胞中的表达

目的获得研发A型猪流感病毒ELISA检测试剂盒和制备NP蛋白单克隆抗体的抗原物质。方法根据已报道的猪流感病毒H1N1亚型NP基因序列(GenBank登录号:GQ422386)人工合成NP基因,通过XbaⅠ和EcoRⅠ特异性酶切,将NP基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTB,经PCR、酶切、测序鉴定后,获得携带NP基因的重组质粒pFast-BacHTB-NP。该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞,经抗生素、PCR筛选,获得转座的杆粒Bac-mid-NP。在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,再感染细胞,收获目的蛋白。结果通过SDS-PAGE和Westernblotting分析表明该蛋白得到表达,且具有良好的生物活性,大小约为57KD。结论实验结果表明已成功构建了携带NP基因的重组质粒pFastBacHTB-NP和转座的杆粒Bacmid-NP,转染后在sf9昆虫细胞上成功的表达。

鹅副粘病毒NP基因的原核表达及表达产物抗原性检测

根据GenBank中发表的GPMVSF02株的NP基因的核苷酸序列设计合成一对引物,通过RT-PCR扩增JS/1/97/Go株的NP基因,将其克隆入pMD18-T载体,序列测定和分析表明:所扩增的NP基因的核苷酸长为1470bp,共编码490个氨基酸。再将NP基因定向亚克隆至原核表达载体pGEX-6P的多克隆位点,经酶切鉴定后将含有NP基因的阳性亚克隆重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,用诱导剂IPTG分别以不同的浓度进行诱导,并在不同的诱导时间进行采样,样品经处理后通过SDS-PAGE、Westernblot和Dot-ELISA进行分析。结果显示:以终浓度为1mmol/LIPTG进行诱导4h表达可达到高峰,表达的融合蛋白大小约为80kD,并具有良好的抗原性。

禽流感病毒A/goose/China/24/96(H7N3)分离株NP基因片段的克隆及其序列同源性分析

本文首次以广东禽流感无致病力分离株A/goose/China/24/96（H7N3）核蛋白（NP）基因核酸为模板,采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术,扩增出了预计的830 bp左右的片段。将此扩增产物克隆进pGEM-4Z载体,采用限制性内切酶、地高辛标记探针和序列测定对该重组质粒进行了鉴定。测出的NP序列经Blast2.0比较,与GenBank中收录的AIV其它病毒株NP基因相应片段的同源性在91％以上。

新城疫病毒TL1株NP基因的遗传变异研究

目的分析新城疫病毒TL1株NP基因部分序列,并与代表性毒株进行比较。方法根据GenBank登陆的新城疫病毒NP基因序列,设计了1对引物,用RT-PCR技术对新城疫病毒内蒙古分离株TL1的NP基因进行整体扩增。将扩增产物提纯后克隆入pGEM-T easy载体,通过酶切、PCR和测序进行验证。结果测序拼接得出NP基因的序列长度为1 528 bp,该基因的ORF总长为1 470 bp,编码489个氨基酸。与GenBank下载的14株参考毒株比较NP基因编码区全核苷酸序列和氨基酸序列,发现TL1株与鹅源新城疫NA-1株核苷酸的同源性为99.5%,氨基酸的同源性为99.0%;与鹅源新城疫ZJ1株核苷酸的同源性为97.6%,氨基酸的同源性为99.2%,而与传统疫苗株LaSota核苷酸的同源性为85.7%,氨基酸的同源性91.6%。结论TL1株与鹅源新城疫NA-1株、ZJ1株的同源性极高,它们三者亲缘关系较近,同属于基因Ⅶ型新城疫病毒,该毒株相对于经典的NDV在NP基因上已发生了较大的变异。

新城疫病毒HB92株NP基因序列测定和分析

对NDVHB92株NP基因进行了序列测定和分析.结果显示,NDVHB92株NP基因全长1744个核苷酸,开放阅读框共1470个核苷酸,编码489个氨基酸;与其他10株NDVNP基因核苷酸同源性为88.3%～99.1%,氨基酸同源性为91.0%～98.9%;但HB92株与其亲本株QV4的核苷酸和氨基酸同源性只有90.3%和95.0%,不如与弱毒和中毒株的高;系统进化分析表明,HB92株与弱毒和中毒株的进化关系更近.以上结果表明,HB92株NP基因在序列上已远离无毒株而趋于向弱毒和中毒株进化.

新城疫病毒V_4株NP基因的克隆、序列测定及真核表达载体的构建

研究新城疫病毒 ( NDV)核衣壳蛋白基因的生物学作用 ,以提纯的 NDV V4 株基因组 RNA为模板 ,化学合成 NP基因的特异核苷酸引物 ,RT- PCR扩增 NP基因 c DNA,得到一条 1 .5kb的DNA带 ,与 NDV NP基因大小一致 ,平端连接克隆到 p UC1 1 9质粒中 .阳性克隆经酶切鉴定及序列分析表明已获得新城疫病毒 V4 株 NP基因克隆 .将 NDV V4 株 NP基因碱基序列与已发表的NDV Beaudettec C株、La Sota株、D2 6株的 NP基因的碱基序列比较 ,同源性分别为 90 .64%、90 .1 7%、98.0 3% ,氨基酸序列差异率是 4.50 %、5.93%、2 .45% .NDV V4 株 NP基因与已发表的NDV Beaudettec C株、La Sota株、D2 6株的 NP基因有所不同 ,但具有高度同源性 .将 NDV V4 株NP基因 c DNA克隆到 pc DNA3 真核表达载体中 ,构建表达

新城疫病毒NP基因的克隆与原核表达研究

参照GenBank新城疫病毒(NDV)LaSota株NP基因序列,设计并合成1对特异性引物。提取NDV LaSota株基因组RNA,利用RT-PCR方法扩增出NP基因片段,将其克隆至pBluscriptⅡKS(+/-)多克隆位点,经PCR检测、酶切及测序检测,结果表明成功克隆获得NP基因。再将NP基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-NDV-NP。经酶切、PCR鉴定后的阳性重组质粒转化感受态BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE分析结果表明,获得该蛋白的高效表达,主要以可溶性形式存在。Western-blot分析表明重组蛋白具有良好的反应原性。

禽流感病毒NP基因的酵母双杂交饵载体表达及自激活检测

目的构建H5N1亚型禽流感病毒NP基因的酵母双杂交诱饵载体,验证其在酵母中的表达并检测其自激活作用。方法以PCR法从pGEMT/H5NP扩增NP基因编码区序列,将其定向克隆到PGBKT7载体,经测序鉴定后,PEG/Li-Ac法转化酵母菌株AH109,用表型筛选法及颜色筛选法检测其自激活作用同时Westernblot验证诱饵蛋白的表达。结果获得NP编码区基因,并成功构建酵母双杂交系统中的诱饵载体pGBKT7-NP,对宿主细胞酵母菌株AH109无毒性和自激活作用,并能在酵母细胞中稳定表达。结论诱饵载体pGBKT7-NP可用于GAL4酵母双杂交系统钓取与禽流感病毒核蛋白相互作用的蛋白。

鸭新城疫病毒NP基因的原核表达与多抗的制备

根据鸭新城疫病毒NP基因序列设计1对特异性引物,RT-PCR方法扩增出NP基因,克隆入原核表达载体pET-30a,转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),在IPTG的诱导下融合蛋白获得了成功表达,SDSPAGE结果显示表达的融合蛋白分子量约为59kD,Western blotting分析表明该重组融合蛋白能与His组氨酸单抗发生特异性反应。将目的蛋白切胶免疫ICR小鼠,制备了针对重组蛋白的多抗血清,Western-blotting分析显示制备的多抗血清能够与鸭新城疫病毒感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明,NP基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的多抗血清可以用于NP蛋白的检测。

禽流感病毒新疆株A/Duck/XJ/4的NP基因序列分析

用RT-PCR法，以1株H5N1亚型禽流感病毒新疆分离株A／Duck／XJ／4为模板，扩增了NP全基因cD-NA，克隆至T载体，并进行序列测定。序列分析结果表明：扩增的NP基因全长1518 bp，最大的开放阅读框在18～1514 bp，编码499个氨基酸。将A／Duck／XJ／4毒株NP基因序列与15株A型流感病毒NP基因序列进行比较，各毒株间NP基因核苷酸序列同源性81．4％～99．0％，编码的氨基酸同源性在92．8％～99．6％。

鸡新城疫病毒F48E9强毒株NP基因的序列分析

根据GenBank登录的鸡新城疫病毒NP基因序列设计引物,利用RT-PCR对F48E9强毒株NP基因进行扩增,将扩增产物经纯化后连入pMD18-T载体,通过PCR和酶切鉴定出阳性重组质粒,经测序后获得F48E9 NP基因序列。经分析发现该基因的ORF总长为1 470 bp,编码489 aa,NP蛋白有4个高度保守的Cys位点,分别位于第55、78、139、213位,且在401～440位和461～481位区域变异较大。将F48E9株与19株参考毒株的相应序列进行比较得到核苷酸序列同源性为87.9%～92.3%,氨基酸序列同源性较高,为92.2%～98.0%,遗传进化分析表明F48E9株相对独立,与参考毒株的遗传距离较远。

狂犬病病毒NP基因的克隆及真核表达

目的检测狂犬病毒NP蛋白的免疫原性。方法利用RT-PCR扩增狂犬病毒核蛋白（NP）基因，测序后将其克隆到PVAXl真核表达载体上：将PVAX1-NP转染Vero细胞，进行SDS．PAGE,TLWestern—blot分析；以重组质粒PVAX1-NP对小鼠进行免疫试验。结果经酶切分析、鉴定和测序验证，得到重组表达质粒PVAX1-NP，NP蛋白在Vero细胞中获得了表达，且表达产物具有免疫学活性：免疫小鼠抗体水平显著升高。结论狂犬病毒NP蛋白具有免疫原性。

A型流感病毒NP基因小干涉RNA表达载体的构建

以A型流感病毒NP基因为靶标,设计并合成了3对编码发夹状siRNA寡聚核苷酸。将合成的序列互补的寡聚核苷酸退火形成双链,克隆至pSilencer 1.0-U6载体中,并转化DH5a菌株,氨苄抗性筛选阳性菌落,扩大培养后,提取质粒进行酶切鉴定,并进行测序分析。结果显示,酶切后得到预期长度的DNA片段;插入序列插入的位置与设计完全一致,无碱基缺失或突变。表明A型流感病毒NP基因小干涉RNA表达载体构建成功。