检测传染性支气管炎抗体NP-ELISA方法的建立

【研究目的】建立可在临床上检测鸡传染性支气管炎抗体的检测IBV抗体的间接ELISA方法;【方法】以表达的重组IBVNP蛋白为包被抗原,将之包被于聚苯乙烯酶标板上,以封闭液进行封闭,然后加待检血清在37℃作用1h,洗涤后加酶标兔抗鸡IgG抗体,在37℃作用1h,加底物显色,终止反应后测定OD值;【结果】抗原包被浓度为1.45μg/ml,待检血清最佳稀释度为1:40,酶标二抗最佳工作浓度为1:1000,确定阳性判定标准为OD450≥0.314。NP-ELISA与AIVH9、H5、H7、IBD、ND、EDS76的标准阳性血清不发生交叉反应,具有良好的特异性;【结论】NP-ELISA具有特异性强、灵敏度高、重复性好、方便快速的特点,可用于临床IB抗体的检测。

检测禽流感病毒抗体的重组核蛋白间接ELISA方法的建立

以大肠杆菌系统表达的H9N2亚型禽流感病毒（AIV）核蛋白（NP）为抗原，建立了禽流感间接酶联免疫吸附试验抗体检测技术（NP—ELISA）。对263份待检血清（包括临床收集的243份血清和20份H9N2亚型AIV免疫鸡阳性血清）进行检测，NP—ELISA与琼脂免疫扩散试验（AGP）的总符合率为83．3％，与血凝抑制试验（HI）的总符合率为92％。特异性试验表明，NP—ELISA方法可以检测H5、H7和H9亚型AIV特异性抗体，检测为阳性的血清样品能够被阳性鸡胚尿囊液阻断。敏感性试验证实，NP—ELISA最早可以检测鸡感染后7d的血清样品，并于感染后10d确定100％血清阳性，而AGP检测直到首免后21～28d才出现部分血清阳性，HI检测直到10～14d才出现部分血清阳性，并且NP-ELISA要比HI敏感4～40倍。试验证明，NP—ELISA是检测AIV血清型特异性抗体的一种特异、敏感、快速、经济的血清学检测技术。

检测禽流感抗体的重组核蛋白间接ELISA方法的建立

以大肠杆菌系统表达的H9亚型禽流感病毒(AIV)核蛋白(NP)为抗原包被ELISA板,通过反应条件的筛选,建立检测禽流感抗体的重组核蛋白间接ELISA(NP-ELISA)方法。结果表明,抗原最佳包被质量浓度为7.56μg/ml,血清最适稀释度为1∶160,作用时间为60 min;辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鸡IgG最适稀释度为1∶5 000,血清和酶标抗体最适作用时间为60 min。特异性试验结果表明,NP抗原可与H5、H7和H9亚型AIV特异性抗体发生反应,经NP-ELISA检测为阳性的H9亚型AI血清样品能够被H9亚型AIV阻断,而NP抗原与新城疫等4种疫病阳性血清不发生反应。对223份待检鸡血清进行检测,NP-ELISA阳性检出率为96.86%(216/223),而血凝抑制试验、琼脂免疫扩散试验结果分别为93.72%(209/223)和81.61%(182/223),表明NP-ELISA是检测禽流感型特异性抗体的一种特异、敏感、快速、经济的血清学检测技术。

AIV NP基因在噬菌体表面的展示及间接ELISA方法的建立

利用DNA重组技术,将禽流感病毒(AIV)核蛋白基因片段克隆重组于溶菌酶缺陷噬菌体T4-z1,获得重组噬菌体T4-z1-NP。经SDS-PAGE和Western blot检测证实,AIV核蛋白成功地在T4噬菌体表面展示。以T4-z1-NP为抗原建立了检测禽流感抗体的酶联免疫吸附试验(T4-NP-ELISA)方法。其与琼脂免疫扩散试验(AGP)的相对灵敏度为100%,特异性为87.62%,T4-NP-ELISA的检测准确率为91.43%。T4-NP-ELISA可检测H5、H7和H9亚型AIV特异性抗体,而IBD、IB、MD、ND、EDS的阳性血清检测结果则为阴性。敏感性试验证实,当阳性血清以1∶640倍稀释时仍能检测到流感病毒抗体,说明该方法比较敏感。对192份血样的检测显示,T4-NP-ELISA与IDDEXX ELISA符合率为96.8%。这表明T4-NP-ELISA可检测AIV抗体,也为检测与诊断AI提供了一种技术选择。

禽流感病毒同义NP蛋白的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立

为建立通用型禽流感病毒(AIV)快速检测方法,本研究将合成的同义NP(ConsNP)基因克隆于pET30a中,利用大肠杆菌系统进行原核表达,以纯化重组ConsN P蛋白作为包被抗原,建立了检测AIVNP抗体的间接ConsNP-ELISA方法,并优化了反应条件。结果表明:抗原包被量为1μg/孔;封闭剂为5%脱脂乳;一抗血清稀释度为1∶200;H RP标记的兔抗鸡IgG(酶标二抗)稀释度为1∶20 000;阴阳性临界值为:O D490nm值>0.239。该间接ELISA方法与其他亚型A IV阳性血清均呈阳性反应,与新城疫病毒,马力克病病毒,禽传染性囊病病毒阳性血清无交叉反应,具有良好的特异性和敏感性。本研究为进一步研制通用型的禽流感ConsN P-ELISA检测试剂盒奠定了基础。

抗A型禽流感病毒核蛋白特异性单克隆抗体研究

利用禽流感H9亚型病毒(AIV-H9)免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,经免疫荧光试验(IFA)检测,以研制抗禽流感病毒(AIV)单克隆抗体。结果获得了5株特异性抗AIV核蛋白(NP)的单克隆抗体细胞株,分别命名为AIV-NP-2C3、AIV-NP-6A5、AIV-NP-3H9、AIV-NP-7B4、AIV-NP-2H4。这5株单克隆抗体能与所有试验的AIV-H9病毒反应,Western blotting方法鉴定结果表明,单克隆抗体仅识别60 ku的蛋白抗原,而不与新城疫病毒、禽网状内皮组织增殖症病毒、传染性法氏囊病毒等反应。初步应用结果显示,以这些单克隆抗体建立的间接免疫荧光试验或ELISA方法可迅速检测出禽流感病毒,这些单克隆抗体在禽流感的预防监测中将发挥重要的作用。

牛副流感病毒3型抗体间接ELISA检测方法的建立与初步应用

旨在建立牛副流感病毒3型(BPIV3)抗体间接ELISA检测方法。克隆NP-HN截短串联基因并构建原核表达载体pET28a(+)-NP-HN,诱导纯化NP-HN重组蛋白作为包被抗原,优化ELISA反应条件,建立BPIV3抗体间接ELISA检测方法,进一步与病毒中和试验和进口ELISA试剂盒进行比较,应用本方法对270份临床血清样本进行了检测。结果表明,表达的NP-HN重组蛋白大小为44ku,具有良好的反应原性,建立的ELISA检测方法特异性强,与牛的主要呼吸道病原如牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒等均无交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数小于8%,与病毒中和试验和进口商品化ELISA试剂盒的总符合率分别为96.67%和98.89%。对采自山东、辽宁和天津的270份临床血清样本检测后总的阳性率为82.59%(223/270)。建立的BPIV3抗体间接ELISA方法具有较好的特异性和敏感性,可应用于BPIV3的流行病学调查和抗体检测研究。

禽流感病毒NP蛋白单克隆抗体的研制和鉴定

应用杂交瘤技术,以低致病性禽流感病毒H9N2亚型(Mildly Pathogenic Avian Influenza Virus,MPAIV)F株作为免疫原,制备出3株稳定分泌特异性单克隆抗体的细胞株C2C5、D3B10和C2H8。对单抗的特异性鉴定结果表明:腹水单抗C2C5、D3B10和C2H8的间接ELISA效价分别为5×214、210、5×212,但均无HI效价。3株单抗的免疫球蛋白亚类均为IgG2a。SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示:单抗C2H8和D3B10与AIV H9N2和AIV H5N1均有60 kD的蛋白条带反应,而不与其他条带反应,表明这两株单抗特异性地针对AIV H9和AIV H5的共同抗原成分60 kD NP蛋白。而C2C5不与电泳蛋白条带反应,说明该单抗不是针对线性表位的,而可能是针对空间表位的。

IBVNP基因的可溶性表达及间接ELISA方法的建立

利用RT-PCR技术将传染性支气管炎病毒M41株的N基因克隆至原核表达载体pET-28a,构建了重组表达载体pET-NP。将其转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后,NP基因获得高效表达。经SDS-PAGE与Western blot-ting检测证实表达的NP蛋白具有免疫学活性,且以可溶性蛋白形式存在。以此抗原建立了检测传染性支气管炎病毒抗体的酶联免疫吸附试验(NP-ELISA)方法。敏感性测定证实,当阳性血清1∶500倍稀释时,D450值为0.356,说明仍能检测到IB抗体,该方法比较敏感。特异性试验显示该法与AIV H9、H5I、BD、ND、EDS76的标准阳性血清不发生交叉反应,具有良好的特异性;NP-ELISA和商品化试剂盒对75份血样的阳性检出率分别为57.33%和61.33%,符合率为85%。NP-ELISA与商品化的HI试剂检测结果没有明显相关性,其效价与攻毒保护也没有相关性。

犬流感病毒重组核蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立H3N2亚型犬流感病毒（cIv）血清学检测方法，本研究利用H3N2亚型CIV重组核蛋白（rNP）作为检测抗原，通过优化反应条件，建立了检测CIV核蛋白血清抗体的间接ELISA方法。通过检测10份SPF犬血清样品确定阴阳性临界值为0．288。该方法检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬副流感毒、犬腺病毒II型、狂犬病病毒、犬弓形虫、犬弓首蛔虫、犬复孔绦虫的阳性血清均为阴性，具有良好的特异性，但与H1N1、H3N8和H9N2亚型CIV有交叉反应。该方法检测H3N2CIV血清抗体的灵敏度为血凝抑制试验（HI）的3～12．5倍；而且其批内批间变异系数为1．85％～6．57％，重复性良好。通过对H3N2CIV攻毒犬血清进行分析，表明该检测方法具有滞后性，检测到CIV抗体的时间晚于HI试验。利用本研究建立的方法和以H3N2CIV为诊断抗原的HI检测方法对450份血清样品进行检测，结果显示该方法对血清样品具有初筛作用，两者阳性符合率为58-3％，阴性符合率为100％。本研究可以结合其它血清学方法为CIV流行病学调查进行快速、高效的检测。

鹅副黏病毒NP蛋白间接ELISA检测方法的建立及免疫鹅抗体水平的检测

以纯化的鹅副黏病毒NP蛋白为包被抗原,建立了检测鹅副黏病毒NP蛋白抗体的间接ELISA方法,并确定了间接ELISA的最适反应条件:抗原包被浓度为1.0μg/mL,血清稀释度为1∶200,兔抗鹅IgG辣根过氧化物酶标记抗体稀释度为1∶2 000,抗原和血清、血清和二抗均于37℃反应1 h,底物于37℃显色15 min。此间接ELISA方法的特异性强、重复性好。应用该方法对试验鹅血清进行检测,以HI试验为参照。经统计学处理后,比较了两方法测得的抗体效价,分别建立了各组鹅群的回归方程。显著性检验证明,这两种方法检测的抗体效价呈显著相关关系。

应用流行性出血热病毒抗NP和G1、G2单抗检测感染细胞和疫苗内的不同抗原成分

应用出血热病毒的抗核蛋白（ＮＰ）和糖蛋白（Ｇ１、Ｇ２）单克隆抗体的ＥＬＩＳＡ夹心法对感染细胞培养物和灭活疫苗内的ＮＰ和Ｇ１、Ｇ２抗原成分进行检测，结果表明感染Ｖｅｒｏ－Ｅ６细胞内ＮＰ和Ｇ１、Ｇ２含量均高于细胞外培养液上清，前者的抗原滴度分别为≥５１２和２５６，后者仅为６４和１６。比较三种不同疫苗内的抗原成分，显示乳鼠脑纯化疫苗内的ＮＰ抗原最高，滴度达３２０－≥６４０，而二种细胞疫苗（沙鼠肾和地鼠肾细胞）则较低，一般在２０－８０，相反二种细胞疫苗的糖蛋白滴度则高于脑疫苗（８－３２对２－８）该方法可用于疫苗生产过程中检测ＮＰ和Ｇ抗原成分。

牛副流感3型NP融合蛋白原核表达及间接ELISA检测方法的建立

为原核表达牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)NX49株截短NP融合蛋白并以此建立间接ELISA检测方法,本研究采用RT-PCR方法扩增了BPIV3截短NP蛋白基因序列并克隆至p ET-28a中进行诱导表达,纯化后产物进行Western blot分析。以重组蛋白作为包被抗原,建立并优化检测BPIV3抗体的间接ELISA方法,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行验证。结果成功表达出截短的NP重组蛋白,该重组蛋白具有良好的反应原性。间接ELISA优化结果如下:抗原包被浓度为4μg/m L,37℃包被1 h后4℃过夜,待检血清以1:80倍稀释37℃孵育1 h,5%脱脂乳37℃封闭1 h。二抗以1:5 000倍稀释37℃孵育1 h,TMB显色时间为15 min。以该蛋白为包被抗原建立的间接ELISA检测方法其特异性为97.4%,敏感性为95.3%,批内、批间检测结果变异系数均小于10%。本试验成功建立检测BPIV3抗体的间接ELISA方法,该方法具有较强的特异性、良好的重复性及敏感性,为开展牛呼吸道疾病综合征的流行病学调查、实验室诊断奠定了基础。

B型流感病毒NP蛋白双单克隆抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立B型流感病毒(IBV)快速诊断方法,本研究采用真核表达系统表达并纯化了IBV中高度保守的核糖核蛋白(NP),以其为抗原,免疫小鼠制备IBV NP蛋白单克隆抗体(MAb),选取抗原表位长、特异性强的MAb2B3-5作为捕获抗体,选取抗原表位短、灵敏度高的MAb 3C3-7经HRP标记后作为检测抗体,经条件优化,建立了检测IBV NP蛋白的双MAb夹心ELISA检测方法。结果显示,该检测方法捕获抗体包被量为每孔100 ng,检测抗体使用量为每孔20 ng,NP蛋白浓度在3.9 ng/mL^62.5 ng/mL时与OD450nm呈良好的线性关系,相关系数R2>0.99。利用该ELISA方法对多种病毒进行检测,结果显示该方法仅能与IBV发生反应,表明该方法特异性强;灵敏度试验结果显示,该方法对病毒NP蛋白的最低检测限为13.26 ng/mL,敏感性高;批内和批间重复性变异系数均小于8%,重复性好;捕获抗体可在25℃和37℃保存4 d,热稳定性好。利用本实验建立的ELISA方法和qPCR方法对本实验室保存的40份人咽拭子进行检测,该方法与qPCR方法相比符合率为70%,表明本研究建立的方法可用于临床检测。本研究建立的ELISA检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为B型流感的快速诊断、NP蛋白功能研究及定量检测提供技术支持。

新城疫病毒核蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA的初步建立

目的制备新城疫病毒(NDV)核蛋白(NP)的单克隆抗体(单抗),并用于建立一种可定量检测NDV病毒含量的双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测方法(NDV NP ELISA)。方法基于NDV病毒株F48E9获得NP基因,经原核表达方式制备出重组抗原rNP;免疫小鼠制备NDV NP特异性单抗;单抗经HRP标记和配对筛选,建立NDV NP ELISA,分析其特异性、灵敏度、精密度、准确度和检测线性,并分析本方法定量检测的NP含量与PFU病毒滴度的定量相关性。结果建立基于单抗3C10和4E7的NDV NP ELISA,其定量检测NDV rNP的最佳线性范围为0.015~0.250μg/ml(R2=0.9974),回收率在88.4%~106.01%,变异系数小于3.4%;该方法具有良好特异性;该方法定量检测NDV抗原含量与PFU病毒感染滴度有较好的相关性(R2=0.9209)。结论建立NDV NP ELISA,可准确定量检测NDV病毒中的NP抗原含量,为NDV病毒含量的测定提供一种可靠简便的分析方法。

蜱媒Dabieshan病毒NP蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

为建立蜱媒Dabieshan病毒血清学抗体检测方法,本研究基于Dabieshan病毒NP蛋白序列,通过建立原核表达体系并优化反应条件,建立一种可用于检测血清NP抗体的间接ELISA方法。结果显示,当重组NP蛋白包被浓度为0.23μg/孔,血清稀释比例为1∶5×10^(4),二抗稀释比例为1∶5000,底物显色时间为15 min时,抗原抗体反应强度最佳。以上述条件建立的间接ELISA方法,与同为白蛉病毒属的发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)阳性血清无交叉反应,具有较好的特异性。批内OD_(450)值变异系数小于10%,重复性较好。结果表明,本研究建立的间接ELISA方法具有较高的特异性和重复性,可进一步用于Dabieshan病毒携带区的人群及动物血清筛查,为了解该病毒的潜在致病性提供流行病学资料。

A型流感病毒NP蛋白双单抗夹心ELISA检测方法的建立

为建立广谱型A型流感病毒(IAV)快速检测方法,本研究选用流感病毒中高度保守的核糖核蛋白(NP)为抗原,采用真核表达系统纯化NP蛋白,并免疫小鼠,按常规方法制备IAV NP蛋白单克隆抗体(MAb)。以制备的SC06 MAb作为捕获抗体,XJ04 MAb作为检测抗体,经条件优化,建立了检测IAV NP蛋白的双单抗夹心ELISA方法。结果显示,该检测方法捕获抗体浓度为2 mg/mL,0.1μg/孔,检测抗体浓度为1 mg/mL,0.05μg/孔,NP蛋白浓度在6.07 ng/mL^101.57 ng/mL时与OD450nm呈良好的线性关系,相关系数R2>0.99。该双单抗夹心ELISA方法可以特异性检测多个亚型IAV,特异性强;与血凝试验相比,该双单抗夹心ELISA方法具有很高的灵敏度,可以检测到20 ng/mL的病毒NP蛋白;批内和批间重复性变异系数均小于8%,重复性好。利用本研究建立的双单抗夹心ELISA方法与RT-PCR方法同时对28份马鼻拭子样品进行检测,结果显示二者总符合率为71.43%。本研究建立的ELISA方法可以用于甲型流感的快速诊断,也可为NP蛋白功能研究及定量检测提供技术支持。

山羊副流感病毒3型NP蛋白的截短表达及间接ELISA方法的建立

为建立山羊副流感病毒3型ELSIA抗体检测方法,利用DNAStar生物信息学软件对山羊副流感病毒3型NP蛋白抗原区域进行预测,利用Primer 6.0软件设计合成1对引物,通过RT-PCR技术扩增到807 bp基因片段,将其连接到原核表达质粒pET28a(+)中,成功表达了相对分子质量约39000的目的蛋白,以纯化后的蛋白为包被抗原,建立检测山羊副流感病毒3型的ELISA抗体检测方法,并对方法的敏感性、特异性、稳定性进行了验证。结果显示,建立的方法具有敏感性高、特异性强、稳定性好等优点;对送检的745份临床羊血清进行检测,总阳性率为14.5%。本试验建立的间接ELISA检测方法为山羊副流感病毒3型抗体的快速检测及流行病学调查提供了技术支持。

鸭源新城疫病毒NP蛋白的原核表达与间接ELISA方法的建立

根据GenBank发表的鸭源新城疫病毒SDWF02株NP基因序列,设计并合成1对特异性引物,扩增出鸭源新城疫病毒的NP基因,与原核表达载体pET-28a构建重组质粒pET28a-NP,经鉴定后转化Rosetta感受态细胞,经IPTG诱导,SDS-PAGE和Western-blot分析表明,54 000的融合蛋白得以表达,该蛋白能与鸭源新城疫的阳性血清发生特异性的反应。以纯化的重组蛋白为包被抗原,建立检测鸭源新城疫抗体的间接ELISA方法,经方阵滴定确定最佳包被质量液为pH9.6的碳酸盐缓冲液,最佳包被质量浓度为10ng/孔,血清最佳稀释度为1∶1 000。经应用试验表明该方法具有良好的特异性、可重复性和敏感性,为临床检测鸭源新城疫抗体水平提供了一种简单、准确、快速的诊断方法。

甲型流感病毒NP含量ELISA检测方法的建立

目的：建立一种双抗体夹心ELISA检测方法,以检测流感疫苗中甲型流感病毒的核蛋白（NP）含量。方法：体外重组表达NP作为ELISA法测定蛋白含量参考品,筛选捕获抗体和检测抗体工作浓度、起始浓度和系列稀释倍数,建立ELISA法并对其进行优化和验证。结果：获得的重组NP纯度为99.0%以上。建立和优化后的ELISA参数：捕获抗体4μg·m L^-1,检测抗体1∶1 000。NP含量参考品起始浓度为300~600 ng·m L^-1,四参数拟合S型曲线的决定系数R^2大于0.95,对疫苗中的甲型流感病毒NP具有特异性,原液和成品的加标回收率为88.2%~95.3%,方法重复性（n=5）的RSD小于15%。结论：建立的流感疫苗中甲型流感病毒NP含量ELISA检测方法特异性好,准确性和精密性高,可用于疫苗样品中甲型流感病毒NP含量的检测。