北部湾海洋真菌Aspergillus fumigatus DL-p0m-g2的化学成分及药理活性研究

为获得具有生物活性的化合物,对一株分离于北部湾钉螺菌株Aspergillus fumigatus DL-p0m-g2的化学成分及药理活性进行研究。综合应用反相ODS(octadecylsilyl)柱色谱、半制备液相等多种色谱学方法进行分离纯化,根据化合物理化性质、质谱和核磁共振波谱学数据进行结构鉴定,并对分离得到的化合物进行细胞毒活性、抑菌活性和胆固醇转运蛋白NPC1L1(NPC1-like intracellular cholesterol transporter 1)蛋白结合等生物活性评价。实验共分离得到21个生物碱类化合物和1个甾体,分别鉴定为6-methoxyspirotryprostatin B(1)、spirotryprostatin A(2)、fumitremorgin C(3)、cyclotryprostatin A(4)、fumitremorgin B(5)、pseurotin A(6)、azaspirofuran A(7)、azaspirofuran B(8)、cephalimysin C(9)、cephalimysin B(10)、fumiquinazoline C(11)、fumiquinazoline B(12)、fumiquinazoline A(13)、fumiquinazoline D(14)、fumiquinazoline F(15)、tryprostatin B(16)、verruculogen(17)、chaetominine(18)、bisdethiobis(methylthio)glitoxin(19)、helvolic acid(20)、7-deacetylpyripyropene A(21)、terezine D(22)。其中化合物6对人肝癌细胞(Hep G2)、人肺癌细胞(A549)、人直肠癌细胞(HCT116)有一定的细胞毒活性;化合物1、3和20对金黄色葡萄球菌表现出抑菌活性;化合物14与NPC1L1蛋白具有较好的结合,显示其在降脂药物开发中的研究潜力。

利用CRISPR/Cas9技术体内标记示踪小鼠内源性NPC1L1蛋白

目的:对小鼠内源性NPC1L1蛋白进行标记和示踪,为研究体内胆固醇的吸收机制提供新的技术手段。方法:利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,针对小鼠NPC1L1基因的3′末端非编码区,设计不同sgRNA,利用细胞内的荧光素酶法,检测分析其Cas9/sgRNA核酸酶活性,筛选出高活性的sgRNA序列,经体外转录制备sgRNA和Cas9 mRNA。PCR扩增基因打靶的两侧同源臂,与FLAG-EGFP的编码cDNA一起克隆至打靶载体。经酶切和测序鉴定正确的打靶载体DNA与sgRNA、Cas9 mRNA一起显微注射入小鼠受精卵,移植至假孕小鼠体内自然发育;通过基因组DNA的PCR和Southern印迹分析,筛选、鉴定重组正确且无随机插入的子代小鼠。制备小肠组织冰冻切片,荧光显微镜下观察NPC1L1-EGFP的表达分布。结果:成功构建了NPC1L1基因敲入打靶载体,筛选了高活性的sgRNA,利用CRISPR/Cas9技术获得了对内源性NPC1L1蛋白C端进行FLAG和EGFP双重标记的子代小鼠,荧光显微镜下观察到该融合蛋白分布于小肠绒毛上皮细胞的刷状缘,与NPC1L1的分布特征一致。结论:成功实现了对小鼠内源性NPC1L1蛋白进行体内标记,为研究NPC1L1囊泡转运和胆固醇吸收机制提供了有效手段。

姜黄素在预防高脂饮食小鼠胆囊胆固醇性结石中的作用

目的研究姜黄素与高脂饮食小鼠胆囊胆固醇性结石关系及可能参与调控过程的因子。方法将C57BL6小鼠50只随机分为5组,其中一组予普通饲料,其余四组予高脂饮食饲料,同时灌喂不同剂量姜黄素[0、200、500、1 000 mg/(kg·d)],共4周。计算小鼠胆囊结石成石率,收集小鼠血液、胆囊胆汁、胆囊、肝脏以及小肠。计算胆囊容积,称量肝脏质量,检测血液及胆汁胆固醇、甘油三酯等生化指标。用Realtime PCR及Western blotting方法分别检测小鼠小肠上皮NPC1L1及SREBP2 m RNA及蛋白表达。结果姜黄素能够降低小鼠胆囊结石的发生,大剂量姜黄素可降低胆囊结石发生率达60%,同时降低肝脏脂肪变性程度,降低小鼠血液胆固醇饱和度。同时,姜黄素可以抑制高脂饮食所致的NPC1L1 m RNA表达上调[(2.65±0.04)vs(2.06±0.07),(1.69±0.06),(1.33±0.05),P<0.01],且呈现剂量依赖关系,降低高脂饮食所致的NPC1L1蛋白高表达。姜黄素还可以抑制高脂饮食所致的SREBP2 m RNA表达上调[(1.34±0.08)vs(1.39±0.03),(1.19±0.01),(1.06±0.03),P<0.05],且呈现剂量依赖关系,降低高脂饮食所致的SREBP2蛋白表达上调。结论姜黄素能够降低高脂饮食小鼠胆囊结石的形成,NPC1L1和SREBP2可能参与了这个过程。

涠洲岛火山口真菌的分离及次级代谢产物鉴定

涠洲岛火山口生态环境特殊,蕴藏着丰富且独具特色的微生物资源。关于涠洲岛火山口海洋真菌来源的次级代谢产物鲜有报道。本研究采用两种培养基从涠洲岛火山口海洋植物中分离真菌,对菌株的代谢产物进行分离纯化,并通过波谱等方法鉴定化合物结构。从4种涠洲岛火山口附近的海洋植物样本中分离真菌共31株,从菌株青霉菌Penicillium sp.TX-M1-3和Penicillium sp.LW-2-1的发酵物中纯化获得2个主要次级代谢产物,并鉴定为核丛青霉素和弯孢霉菌素。活性评价表明核丛青霉素对NPC1L1蛋白具有一定的抑制作用,暗示其在治疗心血管疾病方面的潜力。本结果拓展了涠洲岛火山口微生物资源及其次生代谢产物方面的研究,为该地区微生物与其次生代谢产物的研究提供了相关基础。

落花生根内生真菌Fusarium oxysporum LHS-P1-3中恩镰孢菌素类化合物及生物活性研究

目的研究落花生根内生真菌Fusarium oxysporum LHS-P1-3的次级代谢产物及其生物活性。方法使用硅胶色谱柱、高效液相色谱等对代谢粗提物进行分离纯化,采用质谱、核磁共振等方法测定化合物的结构,采用CCK-8法测试化合物的抗肿瘤细胞活性,使用表面等离子共振实验(surface plasmon resonance,SPR)研究化合物与胆固醇转运蛋白1(niemann-pick c1-like 1,NPC1L1)相互作用关系。结果从落花生根内生真菌Fusarium oxysporum LHS-P1-3分离得到6个化合物,包括1个新化合物(1)与5个已知化合物:白僵菌素(2)、恩镰孢菌素I(3)、恩镰孢菌素MK1688(4)、恩镰孢菌素H(5)及恩镰孢菌素B(6)。化合物1~4对HepG2细胞和HeLa细胞的IC50均小于10µmol/L,化合物2~4则对HCT116细胞的IC50小于10µmol/L,SPR研究表明化合物2、4在20µmol/L浓度下,可与NPC1L1蛋白相互作用。结论化合物1为新的恩镰孢菌素类化合物,命名为恩镰孢菌素W。化合物1~5具有抗肿瘤活性,化合物2、4与NPC1L1蛋白存在相互作用,可能是NPC1L1蛋白的潜在抑制剂。

高山绿茶提取物对小鼠高胆固醇血症及脂肪肝的防治作用及其机制

目的研究高山绿茶提取物(GTE)对小鼠高胆固醇血症及脂肪肝的影响及其作用机制。方法C57 BL/6小鼠随机分为正常对照组、高脂饲料喂养模型组及其加用GTE防治的低、中、高剂量组。喂养28 d后,检测血脂、肝功、肝脏氧化指标,肝脏行HE染色、油红O染色,检测小肠中尼曼-匹克C1样蛋白1(NPC1L1)和甾醇反应元件结合蛋白2(SREBP2)的mRNA和蛋白水平。结果GTE可剂量依赖性地改善小鼠高胆固醇血症、肝功、病理学改变、肝脏氧化损伤与脂质沉积,并降低小肠NPC1L1和SREBP2的mRNA和蛋白水平。结论GTE可预防小鼠高胆固醇血症及脂肪肝,其作用机制与下调小肠NPC1L1和SREBP2基因的表达、减少胆固醇的吸收相关。