生物钟核受体NR1D1在奶牛子宫内膜上皮细胞炎性反应中的作用

本研究旨在构建并筛选干扰效率高的奶牛NR1D1基因慢病毒干扰载体,以探究生物钟核受体NR1D1在大肠杆菌脂多糖(LPS)诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞(BEND)炎性反应中的作用。使用1μg/mL LPS处理BEND 12 h建立炎性反应模型,qPCR检测炎症因子与生物钟基因的表达变化;设计2对靶向奶牛NR1D1基因的特异性短发夹RNA(shRNA)序列和1对无义序列,退火后分别连接至pCD513B-U6载体构建3个重组质粒,随后进行酶切和测序鉴定。将酶切测序鉴定均无误的重组质粒与辅助质粒共转染至HEK293T细胞包装慢病毒,获得病毒颗粒后用其感染BEND,2μg/mL嘌呤霉素筛选获得稳定表达细胞系并使用qPCR和WB鉴定干扰效率。LPS处理NR1D1敲低组与对照组BEND细胞,采用qPCR技术检测炎症因子IL-6、IL-8、IL-1βmRNA的表达变化。结果表明:LPS处理BEND后,IL-6、IL-8、IL-1β等炎症因子显著升高,表明BEND炎性反应模型构建成功。同时,LPS处理后,生物钟核受体NR1D1 mRNA表达量显著升高,提示其可能参与BEND炎性反应的调控;成功构建2个NR1D1基因慢病毒干扰载体sh1和sh2,WB结果显示,sh1和sh2均能有效降低NR1D1的表达,其中sh2的干扰效果最好,使用嘌呤霉素筛选成功获得sh2的敲低细胞系;LPS处理后,炎症因子在sh2细胞系中的表达显著高于shn组。本研究成功构建了奶牛NR1D1基因的慢病毒干扰载体,通过转染BEND细胞,筛选并成功获得了NR1D1敲低的稳定细胞系,发现NR1D1在LPS诱导的BEND炎性反应中可能发挥抑制促炎因子表达的作用,为后续深入探究NR1D1在奶牛子宫内膜炎发生发展过程中的作用机制提供前期基础。

宣白承气汤辅助治疗2型糖尿病黎明现象的效果及其机制

目的观察宣白承气汤辅助治疗2型糖尿病患者黎明现象的效果,并基于核受体亚家族1组D成员1(Nr1D1)预测宣白承气汤的作用机制。方法2型糖尿病合并黎明现象的患者60例,按随机数字表法分为对照组和观察组各30例。对照组采用强化胰岛素治疗,研究组采用宣白承气汤联合强化胰岛素治疗。治疗7 d后记录两组治疗前后3 d的空腹血糖(FPG)、早餐后2 h血糖(2 h PG)、空腹血糖与夜间最低点血糖净增值(∂glucose1)、早餐后2 h血糖与空腹血糖净增值(∂glucose2)、日内平均血糖(MBG)、日内血糖波动幅度(MAGE)。通过TCMSP数据库筛选宣白承气汤关键活性成分,利用Cytoscape3.7.2软件构建中药—活性成分—靶点网络图。采用Maestro11.5软件构建Nr1D1虚拟靶点模型,与宣白承气汤活性成分进行分子对接。结果两组治疗后FPG、2 h PG、∂glucose1、MBG、MAGE均较治疗前降低,且观察组低于对照组(P均<0.05)。观察组低血糖发生率低于对照组(P<0.05)。筛选出宣白承气汤45种活性成分,其中,15个活性成分与Nr1D1具有较好的结合活性。其中,来自大黄的5个成分(MOL000554、MOL002280、MOL002260、MOL002259、MOL002288)主要作用于PHE111、ARG172、GLY174、TYR113、LYS122、ARG126、TYR113、GLY174、GLU119、PHE173、SER109、HID112等氨基酸残基组合的活性位点。结论宣白承气汤联合强化胰岛素治疗可显著抑制2型糖尿病患者黎明现象,减少日间血糖波动。宣白承气汤君药大黄中的活性成分可能通过与Nr1D1结合,进而发挥治疗作用。