NMDA受体亚单位NR2D与MOCA相互作用的鉴定

目的:寻找N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体亚单位NR2D的结合蛋白,为探讨NR2D在视网膜兴奋性毒性损伤中的作用提供依据。方法:构建了包含NR2D细胞内C末端的cDNA片段为诱饵质粒,应用酵母双杂交技术筛选小鼠脑cDNA文库,并用免疫共沉淀实验进一步验证NR2D与其结合蛋白之间的相互作用,免疫荧光显微镜观察NR2D和目的蛋白在视网膜中的共表达。结果:酵母双杂交筛选到细胞黏附修饰因子(modifier of cell adhesion,MOCA)为NR2D可能的相互作用蛋白,两者在视网膜有共定位。结论:MOCA能特异结合谷氨酸受体NR2D,这为进一步研究谷氨酸的兴奋性毒性参与视网膜退行性变的机制奠定了实验基础。

利用酵母双杂交技术筛选与NMDA受体亚型NR2D相互作用的蛋白质

目的利用酵母双杂交技术,寻找可能与谷氨酸受体亚型NR2D存在相互作用的蛋白,为探讨NR2D蛋白在神经系统退行性改变中的作用提供依据。方法应用Clontech GAL4酵母双杂交系统,构建包含NR2D细胞内C末端的c DNA片段为诱饵质粒,筛选人脑c DNA文库;随机挑取部分阳性克隆,通过回复性杂交实验验证其可靠性,分离阳性克隆进行测序和生物信息学分析。结果筛选出6种与NR2D可能存在相互作用的蛋白,包括神经细胞膜糖蛋白(Glycoprotein M6B,GPM6B)、精脒/精胺N1-乙酰基转移酶1(Spermidine/spermine N1-acetyltransferase 1,SAT1)、乳酸脱氢酶B(Lactate dehydrogenase B,LDHB)、α-突触核蛋白(α-synuclein,SNCA)、淀粉样蛋白β前体蛋白结合家族B成员1和2(Amyloid beta(A4)precursor protein-binding,family B,member1(Fe65),APBB1;Amyloid beta(A4)precursor protein-binding,family B,member 2,APBB2。结论初步探讨了NR2D蛋白的功能及与其可能发生互作的蛋白,为进一步研究谷氨酸的兴奋性毒性参与神经系统退行性改变的机制奠定了实验基础。

蛋白免疫共沉淀筛选肾癌A498细胞CXCR4核定位结合蛋白

目的筛选肾癌A498细胞CXCR4核定位结合蛋白。方法采用蛋白免疫共沉淀实验寻找特异性条带,再通过蛋白质谱分析、生物信息学分析寻找可能与CXCR4结合的蛋白。结果 CXCR4抗体进行蛋白免疫共沉淀,发现有3条特异性条带。选取特异性条带行质谱分析提示可能的蛋白共有36个。将这36个蛋白与CXCR4进行生物信息学分析发现NR1D2、c-src及HSPA8有可能与CXCR4相互作用,参与CXCR4核定位。结论 NR1D2、c-src及HSPA8可能参与了A498细胞CXCR4核定位的过程。

chi-miR-128-3p和chi-miR-218对Nr1d2基因的靶向调控研究

为了探究chi-miR-128-3p和chi-miR-218对钟基因Nr1d2的靶向调控关系,以psiCHECK TM-2为载体,构建了野生型和突变型载体,转染293A细胞系,并通过双荧光素酶系统检测,chi-miR-218 mimics能使野生型荧光素酶活性极显著下降,而对突变型荧光素酶活性无影响,说明chi-miR-218靶向Nr1d2基因。该结果对研究受环境影响的生物节律如毛囊发育等现象的机制具有重要意义。

miR-485-3p靶向NR1D2调控宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制研究

目的探讨微小RNA-485-3p(microRNA-485-3p,miR-485-3p)对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及作用机制。方法体外培养宫颈上皮永生化细胞系H8及宫颈癌细胞系SiHa、HeLa和Caski,采用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测细胞中miR-485-3p和核受体亚家族成员1,D组,成员2(nuclear receptor subfamily 1, group D, member 2,NR1D2)mRNA的表达水平;采用蛋白质印迹(Western blot)法检测NR1D2蛋白表达水平。以SiHa细胞为研究对象,转染miR-485-3p模拟物、NR1D2小干扰RNA或过表达载体,细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)法检测细胞增殖;Transwell检测细胞迁移和侵袭;Western blot检测细胞中细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)蛋白表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证了SiHa细胞总miR-485-3p与NR1D2的调控关系。结果与H8细胞做比较,宫颈癌细胞系SiHa、HeLa和Caski中miR-485-3p的表达水平降低(P<0.05),NR1D2mRNA和蛋白的表达水平升高(P<0.05)。过表达miR-485-3p或低表达NR1D2后,SiHa细胞A值、迁移和侵袭数以及细胞中CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达水平均降低(P<0.05)。miR-485-3p在SiHa细胞中靶向负调空NR1D2表达。过表达NR1D2后,SiHa细胞A值、迁移和侵袭数及细胞中CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达水平均升高(P<0.05)。过表达NR1D2逆转了过表达miR-485-3p对SiHa细胞A值、迁移和侵袭数及细胞中CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达的影响。结论 miR-485-3p在宫颈癌细胞系中呈低表达,过表达miR-485-3p可能通过靶向负调控NR1D2抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭。