荞麦NRAMP基因家族鉴定及生物信息学分析

为研究荞麦(Fagopyrum esculentum Moench)自然抗性相关巨噬细胞蛋白(NRAMP)家族成员结构与功能,借助生物信息学手段,从荞麦全基因组数据库中筛选并鉴定荞麦NRAMP家族基因序列,进而对该家族成员的蛋白质理化性质、基因结构、保守结构域、保守基序、亚细胞定位、磷酸化位点、系统进化关系、二级结构和三级结构进行分析。结果表明:在荞麦全基因组中共鉴定出10个NRAMP基因,命名为FeNRAMP1-FeNRAMP10,多数荞麦NRAMP家族成员蛋白质的氨基酸数介于361~605个,跨膜结构数4~12不等,且亚细胞定位除FeNRAMP10定位于液泡膜上外,其他均定位于细胞膜上。进化树分析结果表明,在进化上越接近于FeNRAMP,其基因结构和保守基序也更为相似。除FeNRAMP9蛋白不含有苏氨酸(Thr)磷酸化位点外,其余9个FeNRAMP蛋白的氨基酸序列均含有潜在的丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)磷酸化位点,大部分荞麦NRAMP蛋白的二级结构形式主要是α-螺旋。启动子元件分析表明,多数荞麦NRAMP基因启动子含有参与基因转录、光响应、激素响应等元件。

植物Nramp基因及其与金属离子转运的关系

概述了植物Nramp基因家族及其序列结构分析;在金属离子转运方面的作用机制;表达调控及亚细胞定位;与植物乙烯信号转导途径的核心组分EIN2基因之间的关系等;对今后的研究重点和应用也做了展望。

植物的铁营养与Nramp基因

植物的铁营养与Nramp基因家族密切相关 ,本文论述了植物Nramp基因的克隆 ,Nramp蛋白的结构与功能 ,以及Nramp蛋白在细胞的定位 。

辣椒CaNRAMP基因家族的鉴定与表达分析

为了初步研究辣椒(Capsicum annuum L.)NRAMP家族基因在重金属镉胁迫下的表达情况,通过生物信息学方法从辣椒基因组中鉴定出NRAMP基因,并对这些基因的序列结构、系统进化树、表达谱等进行系统分析。结果表明,辣椒中含有5个具有典型NRAMP结构域的基因,根据其在染色体上的位置,分别将其命名为CaNRAMP1~CaNRAMP5,根据系统进化分析,将辣椒的NRAMP基因分为2类,Ⅰ类包含2个基因(CaNRAMP1、CaNRAMP3),分别含有10、12个内含子,Ⅱ类包含3个基因(CaNRAMP2、CaNRAMP4、CaNRAMP5),均含有3个内含子。基于基因组织表达模式的分析结果表明,CaNRAMP1在不同组织中均未检测到其表达;CaNRAMP5的表达集中在花器官,其余CaNRAMP基因均有不同的表达模式;通过逆转录定量PCR(qRT-PCR)分析发现,辣椒苗期中的叶片经过镉处理后,CaNRAMP3基因呈明显上调的趋势,参与镉胁迫反应的正向调控,其他基因则不参与镉胁迫反应的调控。研究结果为进一步分析辣椒NRAMP基因家族的功能奠定了基础。

基于全基因组的穿心莲NRAMP基因家族鉴定与生物信息学分析

自然抗性相关巨噬细胞蛋白(Natural resistance associated macrophage protein,NRAMP)是一类广泛存在于动植物及微生物中重要的膜转运蛋白,在植物重金属离子转运和重新利用中起着重要作用。为探究穿心莲Andrographis paniculata的NRAMP基因家族生物学特性,本研究根据拟南芥NRAMP家族的蛋白序列,从穿心莲全基因组中筛选鉴定了7个NRAMP家族成员,命名为ApNRAMP1~ApNRAMP7,并分析其基因结构和编码蛋白的理化性质等相关信息。结果表明,ApNRAMPs基因编码蛋白的长度为513~553 aa,分子量在56.00~60.54 kD之间,所有成员均定位于细胞膜上。系统进化分析表明,NRAMP基因家族分为2个亚家族。基因结构分析发现,属于GroupⅡ的ApNRAMP3~ApNRAMP6含有3个内含子,而属于GroupⅠ的ApNRAMP1、ApNRAMP2、ApNRAMP7则含有12个内含子;保守基序分析发现,Motif1~8保守基序存在于所有的ApNRAMPs编码的蛋白序列。蛋白结构预测分析发现,Ap NRAMPs蛋白二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,三维结构较为相似。该研究结果为进一步解析ApNRAMPs基因参与镉胁迫响应的分子机制提供参考。

芥菜型油菜NRAMP基因家族的鉴定与表达分析

芥菜型油菜(Brassica juncea)对重金属有一定的耐受和积累能力,NRAMP(natural resistance associated macrophage protein,天然抗性相关巨噬细胞蛋白)蛋白参与金属离子的吸收和转运,在植物应对重金属胁迫响应中发挥重要作用。本研究以6个拟南芥NRAMP同源基因为参考,从芥菜型油菜中鉴定出18个BjNRAMP基因家族成员,分别定位在12条染色体上。系统进化分析结果表明BjNRAMP基因分属两个进化枝,其基因拷贝数目相比拟南芥增多可能是由于芥菜型油菜基因组三倍化所导致。对芥菜型油菜在不同浓度镉胁迫下根和叶的转录组测序数据进行分析发现,BjNRAMP基因的表达表现出组织特异性,其中BjNRAMP1.4基因在镉浓度为30 mg/kg胁迫下在根中被诱导表达;BjNRAMP2.2基因在镉浓度为10 mg/kg胁迫下在叶片中被诱导表达,而在根中的表达则受到抑制。克隆上述基因并转化至酵母,结果表明过表达BjNRAMP1.4可显著提高镉敏感型突变体酵母对镉的耐受性,而过表达BjNRAMP2.2提升作用有限,不及BjNRAMP1.4。本研究将为研究芥菜型油菜NRAMP基因家族成员结构以及功能提供一定的参考。

杨树NRAMP基因家族全基因组鉴定与生物信息学分析

为研究杨树自然抗性相关巨噬细胞蛋白(NRAMP)家族成员的结构和功能,利用生物信息学方法,从杨树全基因组数据库中筛选并鉴定NRAMP家族基因序列,并对该家族成员的理化性质、二级结构、基因结构、保守基序、染色体定位、进化树和组织表达量进行分析。结果表明:从杨树基因组中共鉴定出6个NRAMP基因家族成员,编码的氨基酸数量差异较大,为503~1310,亚细胞定位表明其均在质膜上,各个成员跨膜结构数量在10~12。PNT31315的二级结构以无规则卷曲为主,其他家族成员主要的二级结构为α-螺旋。进化树分析表明,杨树NRAMP家族基因全部聚类于第3类,且与玉米、高粱、甘蔗和水稻皆有相似基因,不存在物种特异性。染色体定位分析表明,该家族各基因在染色体上分散分布,只有PNT48459和PNT49289两个基因分布在一个染色体上,且不存在串联重复和片段复制基因。蛋白功能预测结果显示,PNT48459和PNT52668可能与植物金属耐受蛋白结合参与金属离子的吸收与转运,PNT31315可能参与植物激素信号转导。PNT48459、PNT37313和PNT31315在主根中的表达量较高,推测其参与重金属吸收过程。

苎麻BnNramp2基因的克隆与生物信息学分析

重金属是主要的环境污染物之一,所有重金属对生物都有潜在的危害作用[1-6]。天然抗性相关巨噬细胞蛋白家族(Natural resistance-associated macrophage protein,NRAMP)是一类广泛存在于微生物、植物、动物中的古老且高度保守的膜整合蛋白家族,参与大多数有机体的金属离子(如Fe^2+、Cd^2+、Mn^2+、Zn^2+、Cu^2+、Ni^2+、Co^2+、Al^3+)的运输[7-9]。目前,已在许多高等植物中发现了NRAMP家族基因。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryza sativa)基因组中,分别存在6和7个NRAMP家族成员,其中一些NRAMP基因的功能已经比较清楚。拟南芥中的Nramp1、Nramp3和Nramp4基因可以转运Mn、Fe和Cd[10-12],而Nramp6只能转运Cd[13]。在水稻中也有相关报道,Takahashi等研究发现OsNramp1基因与水稻根系对镉的吸收和转运过程密切相关,该基因在水稻根部表达量的差异也导致水稻品种间的镉积累量呈现差异[14]。Sasaki等将敲除了Nramp5基因的水稻突变体与野生型水稻植株同时种植在含锰和镉的培养基中,发现突变体根中锰和镉的含量及其净吸收量都显著低于野生型[15]。这些发现促进了对植物Nramp基因转运金属离子的研究,也表明Nramp基因在重金属抗性中起着重要作用。

NtNramp1基因参与不同镉积累基因型烟草品种镉积累差异的功能解析

【目的】探究不同品种烟草镉积累差异的分子机制。【方法】采用同源克隆方法从烟草不同镉积累基因型品种中克隆拟南芥At Nramp1同源基因Nt Nramp1;应用生物信息学方法分析烟草不同镉积累基因型品种中Nt Nramp1基因序列差异;通过酵母异源表达系统研究烟草不同镉积累基因型品种的Nt Nramp1对镉的转运活性差异。【结果】金英和Komotini Basma两个烟草品种对镉的积累存在显著差异;从镉积累显著差异的两个烟草品种中克隆到的Nt Nramp1基因(分别命名为Nt Nramp1a和Nt Nramp1b)编码区存在57个单碱基差异,其中Nt Nramp1a 1305位碱基变异(G>A)导致所编码蛋白比Nt Nramp1b编码蛋白缺少C端两次跨膜;酵母异源表达结果表明来自低镉含量品种金英的Nt Nramp1a转运镉的活性比来自高镉含量品种Komotini Basma的Nt Nramp1b转运镉活性显著降低。【结论】金英和Komotini Basma两个烟草品种中Nt Nramp1蛋白活性差异是导致两烟草品种镉积累差异的重要原因。

大麦NRAMP全基因组鉴定及重金属胁迫下基因表达分析

自然抗性相关巨噬细胞蛋白(natural resistance associated macrophage protein,NRAMP)是植物中一类重要的膜转运蛋白,在转运和重新利用重金属离子中起着重要作用。研究Mn^(2+)、Cd^(2+)、Cu^(2+)三种重金属离子与NRAMP家族基因表达调控之间的作用机制,为进一步明确NRAMP家族基因对大麦抗重金属胁迫的作用提供依据。利用生物信息学的方法从大麦(Hordeum vulgare L.)全基因组中筛选鉴定NRAMP家族基因序列,对该家族成员进行基因结构、保守基序、进化特征及表达谱分析,并利用qRT-PCR的方法检测不同重金属离子胁迫下大麦幼苗中NRAMP基因的表达情况。结果表明,从大麦基因组中共鉴定出10个NRAMP家族成员,且主要定位在细胞膜上;进化分析表明,亲缘关系近的家族成员保守基序、基因结构都更为相似,且大麦与水稻的NRAMP家族成员间亲缘关系更接近;定量检测结果显示,在Mn^(2+)胁迫下,HvNramp1、HvNramp2表达水平显著上调;在Cd^(2+)胁迫下,除HvNramp8表达量显著下调外,其余基因均上调;在Cu^(2+)胁迫下,除HvNramp3外其余6个基因的表达量均显著上调。大麦NRAMP家族基因能够通过正向调控响应重金属离子的胁迫。

猪Nramp1基因多态性与免疫功能的相关性

【目的】探讨Nramp1基因第6内含子多态在大白猪和松辽黑猪(是由杜洛克、长白猪和民猪合成)中的分布及其与猪免疫抗病的关系。【方法】采用PCR-RFLP法对165头大白猪和109头松辽黑猪Nramp1基因第6内含子多态性与免疫功能(中性粒细胞还原力和单核细胞细胞毒百分率)的相关性进行了研究。【结果】两个品种在该位点均存在多态性,品种间、合并基因型间免疫功能差异不大,但同一品种内不同基因型间差异显著;大白猪BB基因型个体的单核细胞细胞毒百分率显著高于AB基因型个体(P<0.05),BB基因型个体的中性粒细胞NBT还原力值极显著高于AB基因型个体(P<0.01),而在松辽黑猪中则是AB基因型个体的中性粒细胞NBT还原力值显著高于BB基因型个体(P<0.05);从断奶到出栏的死亡率分析显示大白猪BB基因型个体死亡率明显低于AB基因型个体,松辽黑猪则是AB基因型个体的死亡率明显低于BB基因型个体。【结论】品种内不同Nramp1基因型与免疫功能间存在着显著相关,Nramp1基因可作为抗病力性状的一个主要候选基因。

牛Nramp1基因启动子的克隆及其活性分析

【目的】牛Nramp1基因是主要的抗病候选基因,但其转录调控的分子机制尚不清楚。本研究欲确定牛Nramp1基因的启动子区域,找到启动子核心序列和主要的调控区,探索Nramp1基因表达机制。【方法】采用基因克隆、DNA测序、半定量RT-PCR和荧光素酶报告基因系统等技术手段,构建牛Nramp1基因5′侧翼区长片段及固定3′端的不同节段的pEGFP-N1和/或pGL3重组质粒,分别转染293T和RAW264.7细胞,并进行脂多糖(LPS)诱导,对不同片段的启动子活性进行定性和定量测定。【结果】牛Nramp1基因5′侧翼区长片段具有较强的启动子活性,+58—-89区域具有基本的启动子功能,+58—-1 748启动子活性最强。进一步研究表明,-89—-205 bp区域、-278—-1 495 bp区域存在着正调控元件,在-205—-278 bp区域内存在着负调控元件;另外,LPS能显著增强启动子活性,其诱导牛Nramp1基因的表达具有细胞特异性和剂量依赖性。【结论】成功构建了含推测的牛Nramp1基因启动子片段的重组报告基因载体,确定了启动子核心区域和主要的调控区域。

合作猪Nramp1基因第六内含子多态性分析

采用PCR-SSCP方法检测了135头合作猪Nramp1基因第六内含子的多态性.结果表明:序列比对分析发现10个新的核苷酸多态位点,其中,转换7个,颠换2个,插入1个;试验群体发现5个基因型,即AA、AB、BB、CC、AC,其中B等位基因为优势等位基因,AB基因型为优势基因型;经χ2适合性检验,该群体处于Hardy-Wein-berg平衡状态(P>0.05);Nramp1基因遗传多态指数中,杂合度为0.617 4,多态信息含量为0.537 3,有效等位基因数为2.613 7.

香猪NRAMP1基因多态性与仔猪腹泻的研究

天然抗性巨噬蛋白1(natural resistance associated macrophage protein 1,NRAMP1)基因是与人、鼠的一些病原微生物(如分支杆菌中的沙门氏伤寒菌等)的易感性和抗性有关的重要候选基因。本研究利用PCR-RFLP技术,分析了香猪的NRAMP1基因第6内含子的NdeⅠ酶切位点的多态性;观测记录哺乳仔猪的腹泻情况,结果发现,NRAMP1基因的第6内含子的NdeⅠ酶切位点在各品种猪表现出丰富的多态性,该酶切位点的基因频率和基因型频率在各猪种中分布趋于一致,香猪不同品系基因型与腹泻指数统计分析结果显示,Ⅰ系、Ⅱ系差异不显著,11世代显著高于10世代。

NRAMP1基因3′UTR多态性与新疆哈萨克族结核病易感性的研究

为了研究人类自然抵抗相关巨噬细胞蛋白NRAMP1基因3′UTR多态性与新疆哈萨克族结核病易感性的关系,研究选取新疆哈萨克族活动性结核病患者213例,新疆哈萨克族正常对照者211人,用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)分析的方法对NRAMP1基因3′UTR多态性进行基因分型,比较不同基因型及等位基因的频率,经统计学分析,探讨NRAMP1基因3′UTR多态性与新疆哈萨克族结核病易感性的关系.结果显示,在新疆哈萨克族活动性结核病患者组中NRAMP1基因3′UTR TGTG+/TGTG+基因型138例(64.8%),TGTG+/del基因型63例(29.6%),del/del基因型12例(5.6%);新疆哈萨克族正常对照组TGTG+/TGTG+基因型则为167例(79.1%),TGTG+/del基因型41例(19.5%),del/del基因型3例(1.4%).新疆哈萨克族结核病患者组TGTG+/del基因型和del/del基因型频率明显高于新疆哈萨克族正常对照组,差异有统计学意义(χ2=10.8,P<0.01);在新疆哈萨克族结核病患者组的TGTG+等位基因频率为79.6%,del等位基因频率为20.4%,新疆哈萨克族正常对照组中TGTG+和del等位基因频率分别为88.9%和11.1%,del等位基因在新疆哈萨克族结核病患者组中的分布频率高,差异有统计学意义(χ2=13.7,P<0.01).研究结果提示TGTG缺失等位基因可能是新疆哈萨克族结核病的易感基因,携带TGTG+/del和del/del基因型的新疆哈萨克族人群可能更易患结核病.

NRAMP1基因DNA多态性与海南黎族人结核病易感性的研究

目的探讨自然抵抗相关巨噬细胞蛋白1(NRAMP1)基因D543N和3′UTR位点多态性与海南黎族人结核病易感性的关系。方法采用病例对照研究设计,共有130例肺结核病例和233例对照纳入本研究,用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析的方法检测入选人群NRAMP1基因中D543N和3′UTR位点的多态性,并对结核病相关危险因素进行问卷调查,进行单因素和基因频率的分析。结果对所有研究对象进行D543N和3′UTR两个多态性位点的基因分型,3′UTR-TGTG+/TGTG-和3′UTR-TGTG-/TGTG-基因型病例组频率显著高于对照组,OR值分别为5.531(2.649-11.549)和0.181(0.087-0.378);D543N位点各基因型频率在病例和对照组中的频率无显著性差异;同时对4个相关危险因素进行了单因素分析,结果性别、酗酒两个因素在病例组和对照组中有显著性差异,OR值(95%CI)分别为3.937(2.459-6.304)和2.435(1.507-3.937),在多因素分析中,调整了性别、吸烟、酗酒3个因素后,3′UTR-TGTG+/TGTG-和3′UTR-TGTG-/TGTG-基因型仍与肺结核显著相关,OR值(95%CI)分别为5.140(2.394-11.034)和4.929(2.769-8.775)。结论NRAMP1基因3′UTR位点多态性可能是海南黎族人结核病的易感因素,D543N位点多态性与海南黎族人结核病的发生无关。

中国荷斯坦奶牛Nramp1基因多态性与泌乳性状及产奶量的关联性分析

为寻找与乳房炎相关的分子标记,为荷斯坦牛的抗病育种提供理论基础,试验采用PCR-SSCP技术和测序的方法对宁夏农垦303头中国荷斯坦奶牛的Nramp1基因进行了遗传多态性分析,利用一般线性模型分析Nramp1基因c.200C>G突变对泌乳性状及产奶量影响。结果显示,Nramp1基因c.200C>G突变与乳脂率、日产奶量和体细胞评分值存在显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)关联。因此,可以把该位点作为中国荷斯坦奶牛体细胞评分、测定日产奶量和日乳脂率的遗传标记进行进一步研究。

BCL10、Nramp1基因多态性与大白仔猪断奶前腹泻关联分析

为研究大白猪BCL10基因和Nramp1基因的单核苷酸多态性,并寻找与大白仔猪断奶前腹泻相关的分子标记,构建490头大白仔猪群体,对仔猪断奶前腹泻情况进行统计,利用PCR-RFLP法检测BCL10基因3′端1149T/C位点和Nramp1基因第六内含子NdeⅠ酶切位点多态性,同时与腹泻频率、腹泻指数和部分生长性状进行关联分析。结果显示:大白仔猪断奶前腹泻率为32.0%,重度腹泻个体的21日龄平均断奶重比正常个体低13.0%,日增重低16.2%,而且大白仔猪在7~11日龄和17~21日龄存在2个断奶前腹泻小高峰。仔猪腹泻粪便病原检测结果表明,22.5%的样本检出为沙门氏菌感染,17.5%的样本检出为致病性大肠杆菌感染。关联分析结果表明:BCL10基因多态性与初生重相关联(P<0.05),TT型个体初生重大于TC型个体,差异显著(P<0.05);BCL10基因多态性与腹泻频率、腹泻指数相关联,差异极显著(P<0.01),个体腹泻频率、腹泻指数均表现为TT>TC>CC,CC与TC之间差异显著(P<0.05),CC与TT之间差异极显著(P<0.01);Nramp1基因多态性与腹泻频率、腹泻指数相关联,差异极显著(P<0.01),个体腹泻频率、腹泻指数均为AA、AB型大于BB型,且AA型与BB型差异显著(P<0.05),AB型与BB型差异极显著(P<0.01)。研究结果表明,BCL10基因和Nramp1基因不同基因型对大白仔猪断奶前腹泻有显著影响,Nramp1基因与猪沙门氏菌感染导致的腹泻有关,BCL10基因3′端1149T/C位点和Nramp1基因第六内含子NdeⅠ酶切位点可以作为大白仔猪断奶前抗腹泻育种分子标记。

3个外种猪Nramp1基因多态性研究

采用PCR-RFLP方法,对3个外种猪群Nramp1基因第6内含子序列多态性进行了检测。结果表明,在3个外种猪群中均仅检测到AB和BB2种基因型,其中AB基因型为优势基因型,BB基因型为数极少,未检测到AA基因型。卡方检验结果表明,3个外种猪群该位点均处于遗传不平衡状态(P<0.01)。群体中该位点杂合度较高、纯合度较低,具有中度遗传多态性,可在后续的育种方案中实施分化选择和培育,为抗病育种提供遗传素材。