NRF-1基因真核慢病毒表达载体的构建及表达

目的:构建核呼吸因子-1(NRF-1)基因慢病毒表达载体并包装成重组慢病毒颗粒,感染大鼠心肌细胞H9c2(2-1)后,筛选出稳定上调表达NRF-1的大鼠心肌细胞H9c2(2-1)。方法:利用lipofectAMINE 2000试剂将pLenti6.3-NRF1-IRES2-EGFP质粒与两种包装质粒在293T细胞中包装成重组慢病毒,收集病毒并测定滴度。用重组慢病毒感染大鼠心肌细胞H9c2(2-1),然后用杀稻瘟素(blasticidin)筛选转染阳性细胞。用PCR法鉴定靶细胞基因组中NRF-1基因序列,用QPCR测定转染阳性靶细胞中NRF-1基因表达量。结果:收集的重组慢病毒滴度为5.5×107TU/ml。转染阳性靶细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光。PCR结果显示,慢病毒携带NRF-1基因序列已插入靶细胞基因组。QPCR结果显示,转染阳性靶细胞中NRF-1基因的表达量是对照组的2.25倍。结论:本研究成功地构建NRF-1基因重组慢病毒表达载体,并在大鼠心肌细胞H9c2(2-1)中表达,为进一步上调NRF-1基因表达后心肌细胞能量代谢的研究提供了实验支持,并为心力衰竭能量代谢的基因治疗奠定了基础。

NRF-1基因多态性与心力衰竭患者疗效以及NRF-1基因表达的关系

分析NRF-1基因多态性与心力衰竭患者疗效以及NRF-1基因表达的关系。方法 选用2020年1月-2022年1月期间本院接受治疗的心力衰竭患者共200例进行分析,采用随机抽签将其分为观察组与对照组,每组100例,对照组实施常规临床检测,观察组在对照组基础上联合NRF-1基因多态性分析,比较治疗前后两组相关生化指标与NT-proBNP、eGFR及PPARγCIα指标。结果 治疗前两组相关生化指标无差异(P>0.05),治疗后观察组相关生化指标均优于对照组(P<0.05);治疗前两组NT-proBNP、eGFR及PPARγCIα无差异(P>0.05),治疗后观察组NT-proBNP指标低于对照组(P<0.05),eGFR及PPARγCIα指标高于对照组(P<0.05)。结论 NRF-1基因多态性与心力衰竭患者临床疗效有关,其作用可能与药物干预后NRF-1基因表达具有一定联系。

杜长大猪NRF-1基因的克隆及白藜芦醇对其表达的影响

为了克隆杜长大猪NRF-1基因,并研究白藜芦醇(RES)对NRF-1基因表达的影响,试验参照GenBank中猪的NRF-1基因序列(XM02107900.1)设计引物,提取2月龄杜长大猪的皮下脂肪组织总RNA,应用PCR技术克隆出NRF-1基因CDS序列并进行生物信学分析;以经白藜芦醇干预和正常喂养的杜长大猪为研究对象,采用实时荧光定量PCR方法检测杜长大猪皮下脂肪中NRF-1基因mRNA相对表达水平。结果表明:成功克隆出杜长大猪NRF-1基因CDS区,长度为1 404 bp;其与参考猪序列比对时发现有1处碱基发生突变,即第666位点A→G,且为同义突变;与猪、小家鼠、大家鼠、人、斑马鱼、豚尾猴等6个物种的NRF-1基因同源性分别为99.9%、91.3%、89.6%、91.3%、76.3%、91.3%;系统进化树分析显示,杜长大猪与普通猪之间的关系较近,与豚尾猴和斑马鱼之间的关系较远;预测杜长大猪NRF-1基因编码467个氨基酸,蛋白质分子质量为49 973 u,等电点为5.18,是亲水性蛋白;在NRF-1蛋白二级结构中,α-螺旋所占比例为42.18%,β-折叠所占比例为7.49%,无规则卷曲所占比例为34.90%,延伸链所占比例为15.42%;实时荧光定量PCR检测显示,经白藜芦醇干预后杜长大猪皮下脂肪中NRF-1基因的相对表达量极显著提高(P<0.01)。说明试验成功克隆出杜长大猪NRF-1基因的编码区序列,经白藜芦醇干预后杜长大猪皮下脂肪中NRF-1 mRNA相对表达水平上调,推测白藜芦醇可能通过上调NRF-1基因的表达促进脂肪代谢,减少脂肪沉积。

NRF-1基因敲除对NRK-52E细胞凋亡的影响

目的探讨NRF-1基因对NRK-52E细胞凋亡的影响。方法构建敲除NRF-1基因的慢病毒重组质粒lentiCRISPR-NRF-1-sgRNA,包装慢病毒,转染NRK-52E细胞,实验设control组、vector组和mutant组;通过嘌磷霉素筛选、T7E1酶切分析、Sanger测序及Western blot法筛选NRF-1基因稳定敲除的细胞系;用含H2O2的完全培养液(终浓度为500μmol·L-1)将control组、vector组和mutant组细胞培养4h建立NRK-52E细胞氧化应激损伤模型。Western blot法检测氧化应激条件下各组细胞中cyt-c、Cleaved-caspase3、Bcl-2、Bax蛋白表达水平;采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率。结果 T7E1酶切分析显示,sgRNA2为NRF-1基因的有效靶点;Sanger测序结果获得了3个基因缺失的突变体;Western blot结果显示,与control组及vector组比较,mutant组细胞中NRF-1蛋白表达水平降低(P<0.05或<0.01);NRF-1基因敲除后,与control组和vector组相比,氧化应激损伤时,mutant组细胞中的cyt-c、Cleaved-caspase3、Bax表达水平增高,Bcl-2表达水平降低(P<0.05或<0.01);Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡结果显示,与control组和vector组比较,氧化应激条件下mutant组细胞凋亡率增高[(11.45±0.64)%vs(3.45±0.14)%,(11.45±0.64)%vs(3.60±0.28)%)(P均<0.01)。结论 NRF-1基因敲除增强了氧化应激条件下NRK-52E细胞凋亡水平。