Caspase-8和caspase-3在镉致NRK细胞凋亡中的表达变化

为研究镉致NRK细胞凋亡中caspase-8和caspase-3 mRNA表达的变化,分别将终浓度为0、10、20、40、60μmol/L的CdCl2添加到培养液中,共同培养6 h。应用TUNEL法检测NRK细胞凋亡形态改变;分光光度法检测caspase-8和caspase-3蛋白活性;半定量RT-PCR检测caspase-8、caspase-3 mRNA。结果表明,随着Cd暴露剂量的加大,NRK细胞凋亡指数升高,caspase-8和caspase-3蛋白活性增强,caspase-8、caspase-3 mRNA转录增加,并呈现剂量效应关系。说明,caspase-8和caspase-3在镉引起的NRK细胞凋亡中起重要作用。

大黄素对体外培养NRK细胞水通道蛋白2表达的影响

目的探讨大黄素对体外培养NRK细胞水通道蛋白2(AQP2)表达的调节效应及机制。方法体外培养NRK细胞,分为两步实验:第一步随机分为对照组和5、10、20mg/L大黄素处理组,采用间接免疫荧光法定性NRK细胞AQP2表达,Westen blot、半定量RT-PCR检测药物处理24h后AQP2蛋白及mRNA的表达;第二步随机分为对照组,20mg/L大黄素组,10mg/L8-Bromo-cAMP组、20mg/L大黄素加10mg/L8-Bromo-cAMP组,采用非放射性法检测药物处理24h后NRK细胞蛋白激酶A(PKA)活性水平。结果 AQP2表达于NRK细胞的细胞膜,进一步的Western blot及半定量RT-PCR结果显示,10、20mg/L大黄素培养液均可抑制NRK细胞的AQP2蛋白及mRNA的表达(P<0.05)。PKA活性结果显示,20mg/L大黄素能降低NRK细胞的PKA磷酸化水平(P<0.05)。结论大黄素可抑制NRK细胞AQP2基因转录与翻译,提示大黄的利尿作用可能与其调节AQP2表达有关,而且有可能是通过PKA通路调节AQP2的表达。

大黄总蒽醌含药血清对NRK细胞AQP2与AQP4表达的调节效应

目的:探讨大黄总蒽醌含药血清对体外培养NRK细胞水通道蛋白2(AQP2)、水通道蛋白4(AQP4)表达的调节效应。方法:16只SD大鼠随机分为正常组、大黄总蒽醌低、中、高剂量组(0,1400,2500,4500mg·kg-1.d-1灌胃),7d后麻醉处死取血制备含药血清。体外培养NRK细胞并给予不同浓度大黄含药血清培养液24h处理,采用免疫荧光检测AQP2、AQP4的定位,Western blot及半定量RT-PCR检测AQP2、AQP4蛋白及mRNA的表达。结果:AQP2、AQP4主要表达在NRK细胞膜上,2500,4500mg·kg-1.d-1大黄总蒽醌含药血清培养液可抑制NRK细胞的AQP2、AQP4蛋白及mRNA的表达,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:大黄总蒽醌含药血清可抑制NRK细胞AQP2、AQP4基因转录与翻译,提示大黄的利尿作用可能与调节AQP2、AQP4表达有关。

钙调素高表达对NRK细胞中DG-PKC和cAMP-PKA水平的影响

钙调素（ＣａＭ）作为Ｃａ２＋的主要受体，对细胞增殖起重要调节作用，而且在转化细胞中ＣａＭ的水平明显高于正常细胞．ｃＡＭＰ作为一种第二信使，起着将细胞外刺激信号转化为细胞内各种生理活动的媒介作用．蛋白激酶Ａ（ＰＫＡ）则是这种转化过程中的关键激酶．蛋白激...

过表达蛋白激酶CβI亚类NRK细胞模型的建立和初步分析

本实验通过逆转录病毒载体pMV7将大鼠蛋白激酶c(Protein Kinase C,PKC)βⅠ亚类cDNA全长片段导入NRK细胞中,建立了一个过表达PKC-βⅠ亚类的NRK细胞模型,并对此细胞模型在佛波脂TPA进一步诱导激活PKC状态下的生长情况及与c-jun基因表达的相关性进行了初步观察。

镉对NRK肾细胞PKCα表达的影响及PKC抑制剂BisⅠ的生物学作用

目的：探讨不同浓度氯化镉（CdCl2）对NRK细胞内蛋白激酶Cα（PKCα）mRNA及其蛋白质表达的影响,以及PKC抑制剂Bisindolymalei mide I（Bis I）对镉染毒NRK细胞PKCαmRNA及蛋白质表达的生物学作用。方法：应用实时荧光定量PCR技术检测不同浓度（0、1.25、2.50、5.00、10.00μmol/L）CdCl2对NRK肾细胞处理6h与12h后PKCαmRNA表达的影响,同时用Western blot技术检测CdCl2对NRK肾细胞内PKCα蛋白质表达的影响。用PKC抑制剂Bis I预处理细胞后,用不同浓度CdCl2（0、2.50、5.00μmol/L）进行染毒,再检测PKCαmRNA及蛋白质的表达变化。结果：CdCl2浓度在1.25~10.00μmol/L范围内,可引起NRK肾细胞内PKCαmRNA及蛋白质表达水平升高,并呈时间_剂量_效应关系;PKC抑制剂Bis I能明显抑制镉引起的PKCαmRNA及蛋白质的表达。结论：CdCl2可以诱导NRK肾细胞内PKCαmRNA及蛋白质表达,PKC抑制剂Bis I具有一定程度抑制CdCl2对PKCα的诱作用,因此在抑制CdCl2对生物机体的伤害作用方面具有生物学意义。

蛋白激酶CβⅠ过表达对NRK细胞生长失调的研究

蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC)是多基因编码具有多功能的蛋白激酶,它在细胞的生长调节中发挥重要作用。很多研究表明,PKC不同亚类在细胞中的生理作用各有差异。为此,我们首次构建了过表达PKC βⅠ亚类的NRK细胞模型,并对此细胞模型在PKC βⅠ亚类过表达状态下的生长特性及与癌基因表达的相关性进行初步观察,以探讨PKCβⅠ亚类在细胞生长调控中的作用及其可能的作用机理。

秋水仙碱对大鼠肾细胞NRK体外毒性机制初步探讨

目的：考察秋水仙碱体外肾毒性及其主要机制。方法：体外培养大鼠肾细胞NRK,通过MTT试验、细胞形态学改变、乳酸脱氢酶释放率、Hoechst/PI双染色法、流式细胞术考察秋水仙碱对大鼠肾细胞NRK是否具有毒性作用,进而阐明秋水仙碱肾毒性产生的可能机制。结果：秋水仙碱在0.1~10μmol/L浓度范围内,对NRK细胞的抑制率呈浓度依赖性。1μmol/L处理组细胞形态学发生明显改变,乳酸脱氢酶释放率随着给药浓度的增加也逐渐增加。Hoechst/PI双染荧光观察10μmol/L处理组细胞处于晚期凋亡及坏死状态,Annexin V-PI双染流式检测细胞凋亡率随着给药浓度的增加而升高。结论：秋水仙碱在0.1~10μmol/L的浓度范围内具有较强的体外肾毒性,其机制可能是秋水仙碱将细胞阻滞在G2/M期,影响细胞的分裂从而诱导细胞凋亡,对细胞产生毒性。

内毒素对NRK52E细胞生长及细胞间缝隙连接功能的影响

【目的】研究不同浓度内毒素(LPS)对NRK52E细胞生长和细胞间缝隙连接功能的影响。【方法】体外培养NRK52E细胞,随机分为对照组及LPS处理组,LPS处理组分别用5个不同浓度的LPS(10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL)作用24h。采用四甲基偶氮唑盐法检测NRK52E细胞的生长;细胞荧光免疫示踪法测定NRK52E细胞间缝隙连接传递的功能;WesternBlotting测定对照组、LPS10ng/mL组和LPS100ng/mL组Cx43蛋白的表达。【结果】①与对照组和LPS10ng/mL组相比,LPS50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL及1000ng/mL组细胞生长明显降低(P<0.01)。②与对照组相比,LPS100ng/mL、500ng/mL及1000ng/mL组细胞间缝隙连接功能明显降低(P<0.01)。③内毒素浓度与NRK52E细胞生长和细胞间缝隙连接传递数目呈负相关(r=-0.941,-0.872,P<0.01)。④与对照组比较,LPS10ng/mL组和LPS100ng/mL组的Cx43蛋白表达明显降低(P<0.05)。【结论】LPS对NRK52E细胞的生长呈浓度相关性的抑制,这种作用与细胞间缝隙连接功能有关。

胆红素和内毒素联合作用对NRK52E细胞缝隙连接功能的影响

目的:观察胆红素(BR)和内毒素(LPS)联合作用对肾小管上皮细胞(NRK52E)生长及细胞间缝隙连接(GJ)的影响。方法:体外培养NRK52E细胞,不同浓度的BR和LPS联合干预,用MTT测量细胞生长;观察它们对生长融合细胞(有GJ形成)和生长未融合细胞(无GJ形成)集落形成的影响;采用细胞荧光免疫示踪法分析细胞间GJ的功能。结果:BR从17.1μmol/L增加至513μmol/L,可浓度依赖性地增加细胞生长;当BR浓度继续增加时,细胞生长逐渐降低。LPS(10-1 000μg/L)能浓度依赖性地降低NRK52E细胞生长。BR和LPS联合作用下,513μmol/L BR增加100μg/L LPS作用下的细胞生长(P<0.05),而684μmol/L BR降低100μg/L LPS的细胞生长(P<0.05);513μmol/L BR能增加100μg/L LPS作用下GJ传递数目(P<0.05),684μmol/L BR降低100μg/L LPS作用下的GJ传递数目。结论:BR和LPS联合作用时,513μmol/L BR降低LPS的细胞毒性,684μmol/LBR增加LPS的细胞毒性,其改变可能是通过细胞间缝隙连接发挥作用的。

镉诱导大鼠肾细胞凋亡及其机理的研究

为探讨镉(Cd)致大鼠肾细胞(NRK cell)凋亡的死亡受体途径,分别将终浓度为0、10、20、40、60μmol·L-1的CdCl2添加到培养液中,对NRK细胞暴露6h.应用流式细胞仪检测NRK细胞凋亡率;分光光度计检测Caspase-8蛋白活性;半定量RT-PCR检测Caspase-8、Fas的mRNA表达.结果表明,随着CdCl2暴露浓度的升高,NRK细胞凋亡率升高,Caspase-8蛋白活性增强,Caspase-8、Fas的mRNA表达增强,并呈现剂量-效应关系.说明镉可以通过死亡受体这条通路来引起NRK细胞凋亡.

镉诱导大鼠肾细胞早期凋亡及bax基因表达的实验研究

目的探讨氯化镉(CdC l2)在不同时间、剂量作用下,诱导正常大鼠肾(NRK)细胞早期凋亡的发生情况以及CdC l2染毒不同时间对bax基因表达的影响。方法选择不同浓度(0~60μm ol/L)CdC l2体外作用NRK细胞12 h及20μm ol/L CdC l2体外作用NRK细胞不同时间(10 m in^24 h),用流式细胞仪检测细胞凋亡;用逆转录-多聚合酶链扩增反应(RT-PCR)的方法观察20μm ol/L CdC l2作用NRK细胞不同时间(0.5~6 h)baxmRNA的表达情况。结果0、5、10、20、40、60μm ol/L CdC l2作用NRK细胞12 h,细胞早期凋亡发生率分别为1.49%、3.77%、7.77%、14.83%、9.69%、7.23%;20μm ol/L氯化镉作用NRK细胞10、20 m in和0.5、2、6、12、24 h后,早期凋亡发生率分别为0.69%、1.16%、2.71%、4.11%、16.72%、14.83%、9.63%;20μm ol/L CdC l2处理NRK细胞0.5、2、6 h后,bax的相对表达量(β-actin为内参照)分别为:对照组0.604±0.184,染毒0.5 h组1.017±0.285,染毒2 h组1.424±0.367,染毒6 h组1.742±0.392。结论CdC l2可以诱导NRK细胞早期凋亡,并可使bax基因表达增强。

镉对大鼠肾细胞毒性和脂质过氧化作用的影响

目的探讨氯化镉对NRK大鼠肾细胞毒性作用和脂质过氧化的影响。方法CdCl2对NRK细胞染毒后,用MTT方法测定细胞的生长抑制,并测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量,观察镉的细胞毒性和对脂质过氧化影响。结果MTT实验显示CdCl2对NRK细胞的生长抑制作用随染毒浓度增加而增强,呈明显的剂量—效应关系;CdCl2染毒后使细胞培养液中LDH、MDA浓度高于对照组,而SOD水平低于对照组。结论CdCl2对NRK细胞有一定的细胞毒性作用,并对NRK肾细胞的脂质过氧化有明显影响。

姜黄素减轻泛影葡胺引起的大鼠肾小管上皮细胞损伤作用的研究

目的探讨姜黄素(CMN)对泛影葡胺所致的大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E)损伤的保护作用及其机制。方法将培养的NRK52E细胞分组,分别与泛影葡胺/CMN/锌原卟啉Ⅸ(ZnppⅨ)等进行孵育,测定各组细胞活力、培养液中丙二醛(MDA)含量、细胞凋亡率及HO-1表达量。结果泛影葡胺呈时间依赖性和剂量依赖性抑制NRK52E细胞活力(P<0.05),并显著增加细胞氧化应激损伤和细胞凋亡率(P<0.05);CMN能呈剂量依赖性诱导NRK52E表达HO-1(P<0.05),并能显著减轻泛影葡胺对NRK52E的损伤,降低细胞凋亡率(P<0.05)。加用ZnppⅨ可抑制CMN所诱导的HO-1表达并消除CMN对NRK52E的保护作用(P<0.05)。结论泛影葡胺可导致NRK52E氧化应激损伤,促进细胞凋亡。CMN能通过上调HO-1表达,显著减轻泛影葡胺所致的NRK52E氧化应激损伤,抑制细胞凋亡。

异常蛋白负荷诱导鼠肾小管上皮细胞CD54表达及细胞骨架变化

目的了解异常蛋白负荷对鼠肾小管上皮细胞 CD5 4(ICAM- 1)表达的影响及细胞骨架蛋白的中间丝波形蛋白 (vimentin)表达的影响。方法用 Ig G(10 m g/ m L )和不同浓度的牛血清白蛋白 (BSA) (1,15 ,30 mg/ m L )作用于体外培养的鼠肾小管上皮细胞株 (NRK 5 2 E) ,采用流式细胞仪测定细胞表面 CD5 4的平均荧光强度的变化 ;对 Ig G和 BSA刺激下的爬片细胞用免疫组化的方法检测 vimentin表达的变化。结果 Ig G能引起 CD5 4表达上调 40 .1% (P<0 .0 5 ) ,BSA(15 ,30 m g/ m L )能引起 CD5 4表达上调 2 4.8%和 2 5 .0 % ,但无统计学意义 ;Ig G和 BSA(15 ,30 m g/ m L )可刺激肾小管上皮细胞表达 vim entin(P<0 .0 5 )。结论异常蛋白负荷可诱导肾小管上皮细胞粘附分子表达上调和细胞骨架的变化 ,从而可能是导致肾小管间质炎性浸润和瘢痕化的重要因素之一。

ATP缺失对大鼠近端肾小管上皮细胞中肌动蛋白磷酸化水平的影响

目的:研究ATP缺失时大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E)肌动蛋白磷酸化水平的改变。方法:建立细胞的体外ATP缺失模型,用免疫印迹技术检测细胞内骨架组分及胞浆组分中肌动蛋白的分布变化;用二维电泳法分离并比较细胞内磷酸化和非磷酸化的肌动蛋白含量的改变;用免疫共沉淀法及免疫印迹技术检测ATP缺失后细胞内肌动蛋白酪氨酸、苏氨酸及丝氨酸磷酸化水平变化。结果:ATP缺失处理后细胞内F-肌动蛋白含量逐渐增加,G-肌动蛋白含量逐渐减少;ATP缺失细胞内磷酸化肌动蛋白量明显增加,肌动蛋白的磷酸化程度随ATP缺失时间延长而增加;ATP缺失处理后肌动蛋白酪氨酸磷酸化水平逐渐升高,且与ATP缺失程度呈相一致;肌动蛋白苏氨酸磷酸化水平无明显变化。结论:ATP缺失后近端肾小管上皮细胞肌动蛋白出现聚合过程,可能与细胞中肌动蛋白磷酸化酪氨酸水平增加有关。

ATP缺失时大鼠近端肾小管上皮细胞骨架重组与ERM蛋白的重分布相关

目的:探讨ATP缺失时大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E细胞)肌动蛋白细胞骨架重组情况及其可能机制。方法:用含0.1 μmol/L antimycin A的ATP缺失缓冲液处理培养的NRK52E细胞,建立细胞的体外ATP缺失模型;采用FITC标记的鬼笔环肽标记纤维型肌动蛋白(F-actin),用流式细胞仪检测技术分析肌动蛋白细胞骨架的重组情况;用Westernblot及免疫印迹技术检测ATP缺失后NRK52E细胞内骨架组分(Triton不溶组分)及上清组分(Triton可溶组分)中ERM(Ezrin/Radixin/Moesin)蛋白的分布改变。结果:体外ATP缺失模型建立,各实验组细胞内ATP浓度呈时间依赖性的下降(P<0.05);ATP缺失后,NRK52E细胞内纤维型肌动蛋白的量渐增,且肌动蛋白的聚合程度随ATP缺失时间延长而增加(P<0.05);ATP缺失后,ERM蛋白从细胞骨架解离进入胞浆,且ERM蛋白从细胞骨架的解离程度随ATP缺失的程度的增加而增加(P<0.05)。结论:ATP缺失后NRK52E细胞骨架重组可能与ERM蛋白的重分布相关。

氯化镉对NRK肾细胞DNA损伤及细胞凋亡作用

目的观察氯化镉对大鼠肾细胞(NRK)DNA损伤和细胞凋亡的影响。方法用不同浓度氯化镉(0,2.5,5,10,20μmol/L)染毒NRK细胞12 h,应用Hoechst/PI双荧光活性染色检测镉致NRK细胞的凋亡率;单细胞凝胶电泳法检测镉对NRK细胞DNA的损伤。结果Hoechst/PI双染检测2.5,5,10和20μmol/L镉染毒组的细胞凋亡率分别为5.9%,12.4%,24.6%和46.2%,与对照组比较明显升高。单细胞凝胶电泳检测5,10和20μmol/L染镉组的尾部DNA含量和尾长,比对照组明显增加,且各染镉组与尾部DNA含量和尾长存在剂量-效应关系。结论氯化镉可诱发大鼠NRK细胞凋亡,DNA损伤是镉致NRK细胞凋亡的主要原因。

p38MAPK和ERK1/2对镉诱导NRK肾细胞c-myc与c-fos基因mRNA表达的影响

目的研究p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和细胞外信号调节激酶(ERK)1/2抑制剂对镉染毒NRK肾细胞后原癌基因c-myc与c-fos表达的影响。方法用不同剂量CdCl2(0、2.5、5.0、10.0μmol/L)染毒大鼠NRK细胞12h,p38MAPK抑制剂SB20358010.0μmol/L和ERK1/2抑制剂PD9805910μmol/L预处理NRK细胞0.5h后,再加入10.0μmol/L CdCl2染毒细胞,用流式细胞技术检测细胞凋亡率,SYBRGreenI荧光定量PCR检测c-myc与c-fos mRNA表达。结果流式细胞仪检测NRK细胞染镉后细胞凋亡率随染毒剂量增加而增加;p38MAPK抑制剂SB203580+10.0μmol/L CdCl2组与单独染镉组比较,细胞凋亡率显著下降;但ERK1/2抑制剂PD98058+10.0μmol/LCdCl2组与单独染镉组比较,细胞凋亡率显著升高。实时荧光定量PCR检测NRK细胞染镉后c-myc和c-fosmRNA表达明显增强;单独用SB203580和PD98058刺激NRK细胞后c-myc和c-fos mRNA表达与对照组比较,差异无统计学意义,但SB203580和PD98058预处理NRK细胞0.5h后加入10.0μmol/L CdCl2与单纯10.0μmol/L染镉组比较,c-myc和c-fos mRNA表达显著降低。结论MAPK信号转导通路可能在镉诱导原癌基因c-myc和c-fos表达中发挥作用。