非核糖体肽合成酶(NRPSs)作用机理与应用的研究进展

许多微生物能利用非核糖体肽合成酶(NRPSs)合成结构复杂、种类繁多的的生物活性肽。非核糖体肽因其独特的理化特性和药理学特性已被广泛关注,极具商业开发潜力。NRPSs由多个模块组成,模块的不同空间排列顺序决定其多肽产物的氨基酸序列特异性。NRPSs以多载体巯基化模板机理进行多肽合成,其底物特异性由腺苷酰化结构域和缩合结构域共同实现。目前,人们已经利用天然的NRPSs、某些特定结构域、将已知NRPSs的模块或特定结构域进行组合甚至杂合组合而构建成的新的NRPSs来合成目的多肽。

组合生物合成模块资源挖掘与开发的研究进展

从数据信息和实验技术角度,综述了近年来组合生物合成模块资源的挖掘和开发利用进展,结合“点击化学(Click chemistry)”技术,对天然产物实际的组合生物合成过程中存在的若干问题进行了探讨和展望。Click化学作为组合化学(combinatorial chemistry)领域中的新技术,可以在组合生物合成的基础上实现更多类型及更好活性的新化合物,促进组合生物合成在遗传操作和化学修饰两个维度上的拓展应用。

牛樟芝非核糖体多肽合成酶基因(AcNRPS)的克隆与鉴定

胶霉毒素属于真菌天然次生代谢产物epipolythiodioxopiperazine(ETP)家族,具有免疫抑制剂、抗真菌等多种生物活性,是由非核糖体多肽合成酶(NRPSs)催化合成。从牛樟芝(Antrodia camphorata)基因组中挖掘出非核糖体多肽合成酶基因(AcNRPS,NCBI登录号为KX430967),克隆获取其全长cDNA,并对其进行生物信息学分析和表达谱分析。结果显示AcNRPS基因cDNA全长6 687 bp;与其DNA序列比对发现AcNRPS基因含有12个内含子;其开放阅读框编码2 229个氨基酸残基,BLAST比对发现其含有2个A-C-T结构域,底物需2个氨基酸;系统发育树结果显示AcNRPS与其他合成产物为胶霉毒素的NRPS基因聚为一类,其可合成胶霉毒素类化合物;表达谱分析显示,以葡萄糖和土豆蛋白胨作为碳、氮源的培养基能够有效促进牛樟芝NRPS基因的表达。

枯草芽孢杆菌MH25 Iturin A操纵子的克隆与分析

根据已知非核糖体肽合成抗生素操纵子的保守序列设计引物,从对棉花立枯病有很好拮抗作用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)MH25菌株中克隆相关操纵子。获得了枯草芽孢杆菌MH25的一个非核糖体肽合成抗生素操纵子序列,其包括4个ORF(ORF1,ORF2,ORF3,ORF4),与枯草芽孢杆菌RB14的ituD,ituA,tiuB和ituC的同源性分别为99%,98.70%,98.99%和99.48%,4个ORF编码的氨基酸序列与ItuD,ItuA,ItuB,ItuC的相似性分别为98%,98.54%,98.69%和98%。然后将4个ORF分别进行结构域分析,ORF3的14 779～14 963序列与ituB相对应区域的相似性为86.24%。该操纵子的启动子区为TATACACA-16bp-TAGGAT,与σA-10和-3(5 TTGACA-17bp-TATAAAT)不同。枯草芽孢杆菌MH25的Iturin A操纵子序列已在GenBank中注册,登陆号为EU263005。

深海放线菌Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652遗传操作系统的建立

目的建立深海放线菌Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652菌株的遗传操作系统,通过基因阻断研究次级代谢产物的生物合成途径。方法在对该菌株的全基因组进行测序的基础上,以基因组序列中编码非核糖体肽合成酶(Non-ribosomal peptide synthetase,NRPSs)的基因s102-A和s63-A为目标基因,利用PCR-targeting介导的基因置换技术构建了重组质粒,在加有3%海盐的培养基上,通过ET12567/pUZ8002属间接合转移导入SCSIO 00652野生菌。结果接合子通过一代、二代松弛培养都无法得到双交换突变菌株,松弛培养四代后经抗性筛选,双交换率明显提高,PCR分析结果显示s102-A基因和s63-A基因均被成功阻断,HPLC分析结果显示突变株的发酵产物与野生型菌株有一定的差异。结论成功建立了深海放线菌M.thermotolerans SCSIO 00652的遗传操作系统,为对其它基因进行遗传学操作奠定了基础。

真菌单模块非核糖体肽合成酶的基因组挖掘与天然产物研究

真菌非核糖体肽(nonribosomal peptides,NRPs)是一类重要的次级代谢产物,其中不乏结构和功能特殊、可作药用的化合物。本文介绍了组成非核糖体合成酶(nonribosomal peptide synthases,NRPSs)各结构域的功能,综述了已有报道的两种单模块非核糖体合成酶,即仅含有腺苷化结构域(adenylation domain,A结构域)、巯基化结构域(thiolation domain,T结构域)、硫酯酶结构域(thioesterase domain,TE结构域)的NRPSs:A-T-TE和仅含有腺苷化结构域、巯基化结构域、一个还原酶结构域(reductase domain,R结构域)的NRPSs:A-T-R的生物合成产物,并结合生物信息学分析推测了第3种含有腺苷化结构域、巯基化结构域、两个还原酶结构域的单模块NRPSs:A-T-R-R可能合成的产物结构。

环肽的分析方法与研究

环肽是一种较线性多肽更为稳定的具有多种生理功能和医药价值的环状多肽,在形成荷尔蒙、抗生素、离子载体系统、抗真菌素、癌制剂以及毒素等方面展现出丰富多样的生物活性,具有重大的应用价值。近年来随着生物技术以及生物学与化学领域的交叉发展,不断有新的环肽被分离并鉴定出来。本文综述了自然界存在的一些环肽及环肽的分离纯化、分析方法,并且对环肽的生物合成机制和化学合成进行了概述。

非核糖体肽合成酶的末端硫酯酶与多肽环化

非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetases,NRPSs)能以多载体巯基化模板机制合成各种结构复杂、种类繁多的次生代谢非核糖体环肽.根据环肽末端环化的方式,可分为两大类:大环内酯型和内酰胺型.负责非核糖体环肽最终环化的硫酯酶(thioesterase,TE)属于α/β水解酶超家族.该家族包括:脂酶、蛋白酶、酯酶等,其共有特征是含有保守的催化三元件(Ser-His-Asp),起到终止反应和释放产物的功能.TE具有区域定向性(regiospecific)、化学定向性(chemospecific)及立体定向性(stereospecific)的特点,在非核糖体肽(nonribosomal peptide,NRP)的合成反应中具有决定性作用,直接影响到最终环肽的生成.同时,TE由于其特有的环化和水解的双重活性,在体外的线性多肽环化中越来越受到众多学者的关注.综合国内外相关文献,本文着重从TE介导下的产物释放机制和影响因素两个方面综述非核糖体末端硫酯酶的研究进展及其应用.

组合生物合成研究进展

组合生物合成是通过对微生物代谢途径中一些酶的编码基因进行操作,从而获得许多新的"非天然"天然产物。本文重点介绍聚酮合酶(PKSs)和非核糖体多肽合酶(NRPSs)的分类、作用机制及其杂合系统在组合生物合成应用研究中相关报道。另外,对于PKSs和NRPSs在大肠埃希菌中的异源表达也作了简单介绍。

多粘类芽孢杆菌及其脂肽化合物研究进展

芽孢杆菌(Bacillus spp.)和类芽孢杆菌(Paenibacillus spp.)可产生丰富的代谢化合物,尤其是拮抗微生物类的脂肽化合物,是挖掘天然抗菌素的宝库,其中多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa最具有代表性。多粘类芽孢杆菌的生防机制与其脂肽化合物相关。已发现与微生物拮抗作用相关的脂肽主要有杀镰孢菌素、多粘菌素和十三肽素,是由大的多酶复合体非核糖体肽合成酶(NRPSs)产生。本文在简介多粘类芽孢杆菌脂肽在植物病害防治和医疗应用的基础上,综述了其产生的脂肽化合物的类型和功能,并结合作者的研究工作,重点介绍了与抗菌作用相关的杀镰孢菌素、多粘菌素和十三肽素化合物的结构、生物活性、作用机制、类似物的合成和质谱检测等方面的研究进展,并展望了该领域的未来研究发展趋势,旨在为进一步发现、挖掘和利用脂肽化合物的自然资源提供参考。

硬枝树花中非核糖体多肽合成酶NRPS基因的克隆与鉴定

以硬枝树花(Ramalina conduplicans)地衣型真菌为研究材料,采用简并引物扩增获得腺苷酰化结构域(A结构域),并以其为模板,通过Gene walking的方法获得非核糖体多肽合成酶(NRPSs)基因的全长,并对Rc NRPS基因进行生物信息学分析、分子系统进化分析及RT-PCR分析。Rc NRPS基因的开放阅读框总长3 150 bp,编码1 049个氨基酸残基。结构域分析显示:硬枝树花的NRPS基因含有腺苷酰化结构域(A结构域)、巯基化结构域(T结构域)、缩合结构域(C结构域)。将硬枝树花的Rc NRPS蛋白序列与曲霉属34条NRPS蛋白构建系统进化树,结果显示其为铁载体。生物信息学分析表明:NRPSs为非分泌蛋白,定位于细胞质基质中。RT-PCR分析表明:酵母粉是Rc NRPS基因诱导表达所必需的,蔗糖可有效促进该基因的诱导表达。

罗氏海盘车(Asterias rollestoni)中2种生物碱的分离纯化及其抗肿瘤活性研究

目的从罗氏海盘车(Asterias rollestoni)中分离鉴定生物碱类天然产物,并进行体外抗肿瘤活性评价。方法利用凝胶吸附树脂柱层析、硅胶薄层层析、硅胶柱层析、凝胶Sephadex LH-20柱层析和高效液相色谱等手段对化合物进行了分离纯化;运用NMR、MS等波谱方法并结合文献鉴定化合物的结构;采用SRB、MTT法评价化合物的体外抗肿瘤活性。结果从罗氏海盘车的乙醇提取物中分离鉴定了1个吲哚生物碱N-(2-苯乙基)-1H-吲哚-3-乙胺(1)和1个环二肽生物碱类化合物Fellutanine A(2)。化合物2对MGC803细胞的抑制率为53.99%,具有一定的抗肿瘤活性。结论 2个生物碱类化合物均为首次从罗氏海盘车中分离获得;化合物1为首次分离到的天然产物,其核磁数据为首次报道;化合物2具有一定的抗肿瘤活性。