定量PCR-Taqman探针法检测NS0宿主细胞残留DNA的方法学验证

目的NS0宿主细胞残留DNA检测(定量PCR-Taqman探针法)方法的验证。方法针对小鼠骨髓瘤细胞(NS0)基因组重复序列设计合成多对引物、探针,通过实验优选最佳的引物探针组合;应用所建立的前处理试剂盒(磁珠法)对供试品中宿主细胞残留DNA进行富集纯化;根据《国际人用药品注册技术协调会(ICH)》及《中国药典》通则9101的要求,应用所建立的NS0宿主细胞DNA残留检测试剂盒进行线性与范围、准确度、精密度、专属性、定量限的方法学验证。应用NS0细胞生产的单克隆抗体工艺中间品及原液,验证所建立试剂盒对实际生产样品的检测性能,并组织5个独立实验室进行协作标定。结果 NS0细胞DNA检测(Taqman法)正向引物序列:CCCCTTCAGCTCCTTGGGTA、反向引物序列:GCCTGGCAAATACAGAAGTGG、荧光探针序列:FAM-AGGGCCCCCAATGGAGGAGCT-TAMRA;NS0细胞DNA标准曲线在3 fg·μL^-1~300 pg·μL^-1内,线性良好(r2> 0. 99);对6个浓度梯度检测的准确度偏差均<15%;定量限为3 fg·μL^-1;内部参考品DNA标定结果为30μg·m L^-1;精密度良好(RSD≤30%);能特异性地检测NS0细胞DNA,对大肠杆菌DNA、人类基因组DNA(人肾上皮293T细胞)、CHO(中国仓鼠卵巢)细胞DNA无扩增反应。另外,对于生产工艺中间品及原液的检测回收率均在70%~130%,RSD均<15%。5个独立实验室间协标检测数据RSD均<30%。结论自主研发NS0宿主细胞DNA残留检测试剂盒(定量PCR-Taqman探针法)特异性强、灵敏度高、准确度好,能够满足NS0宿主DNA残留检测要求。

生物制品中宿主细胞残留DNA检测的研究进展

宿主细胞残留DNA是指可能出现于生物制品中的来自宿主细胞的DNA片段。用传代细胞株生产的生物制品,其宿主细胞残留DNA可能会传递肿瘤或病毒相关基因,存在潜在的危险性。各国药品监督管理机构对宿主细胞DNA的残留量有着严格的限度控制,同时各国药典也提供数种经典的检测方法。建立合适的宿主细胞残留DNA检测方法有助于监测生产工艺,确保生物制品的安全性和质量。此文对宿主细胞残留DNA潜在的危害、国内外监管机构对宿主细胞残留DNA检测标准和检测方法以及各方法的特点及研究进展做一综述。