基于NS3-gym框架的智能干扰规避系统设计与实现

多智能体构建的无线通信网络在受到外部恶意干扰时,智能体需要与环境进行大量交互来学习干扰规律和优化抗干扰策略。为了有效模拟和验证智能体与外部干扰环境的学习交互过程,需要构建智能干扰规避仿真系统。提出了一种基于NS3-gym框架的智能干扰规避系统,NS3模拟智能通信网络场景并将感知到的网络状态数据作为智能体的输入,智能体对输入数据进行学习分析得到干扰规避决策,并通过gym与NS3之间的交互将其返回到NS3中的仿真网络进行抗干扰策略部署。NS3-gym框架提供了NS3和OpenAI gym之间进行信息交互的接口。在Ubuntu20.04系统下搭建了智能干扰规避系统的仿真平台,分别验证了Q学习算法以及WoLF-PHC算法在扫频干扰、贪婪随机策略干扰、跟随干扰、随机干扰四种场景下的抗干扰性能。仿真结果证明了所提系统架构与仿真平台的正确性和有效性。

牛病毒性腹泻病毒NS3基因的生物信息学分析、蛋白纯化及免疫原性分析

为了探讨牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3(P80),并获得具有较高免疫原性的NS3重组蛋白,利用生物信息学研究方法对NS3蛋白氨基酸进行序列分析;经PCR技术扩增NS3基因序列;通过无缝克隆技术构建pET-22b(+)-NS3重组表达质粒,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,诱导其表达NS3重组蛋白并提纯;通过Western Blotting方法检测其反应原性;将获得的较高纯度的NS3重组蛋白免疫BABL/c小鼠,收集血清,ELISA方法分别检测血清中IgG、IgG1和IgG2a抗体水平;最后通过病毒中和试验检测其中和病毒的能力。结果表明:NS3蛋白氨基酸序列中无信号肽和跨膜区,二级结构主要以无规则卷曲为主,且NS3氨基酸序列中含有优势抗原表位;利用PCR和无缝克隆技术成功构建了pET-22b(+)-NS3重组表达载体,经诱导表达获得了较高纯度的NS3重组蛋白,大小约为75 ku,与理论大小相符;Western Blotting结果表明,NS3重组蛋白具有较高的反应原性;ELISA检测NS3重组蛋白免疫后的小鼠能够产生高水平的IgG、IgG1和IgG2a抗体,结果显示,免疫组小鼠产生的抗体水平极显著高于PBS阴性对照组(P<0.01);血清中和抗体水平也极显著高于PBS阴性对照组(P<0.01)。总之,成功获得了纯度高且具有免疫原性的NS3重组蛋白。

基于荧光法及分子对接研究黄褐毛忍冬抑制丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶活性

目的基于荧光实验及分子对接研究黄褐毛忍冬抗丙型肝炎病毒(HCV)NS3/4A蛋白酶的活性。方法采用荧光法测试黄褐毛忍冬提取物抑制HCV NS3/4A蛋白酶活性,分子对接分析主要活性成分与HCV NS3/4A病毒蛋白酶结合情况。结果黄褐毛忍冬水提物、醇提物能较好的抑制HCV NS3/4A蛋白酶活性,半数抑制浓度(IC_(50))为0.005~0.019 mg/ml。分子对接和相互作用分析发现绿原酸、异绿原酸A、木犀草苷、木犀草素与HCV NS3/4A蛋白酶结合较好,可形成多个氢键。结论初步明确异绿原酸A和木犀草素是黄褐毛忍冬抗HCV NS3/4A蛋白酶活性的有效成分。

C株猪瘟病毒NS3蛋白抗原表位分析及分段表达活性检测

以经典毒株C株的基因组为模板,测序后对NS3蛋白的二级结构进行分析,并对抗原表位进行预测,结果表明NS3的二级结构非常丰富并且存在丰富的B细胞抗原表位和T细胞抗原表位。截获3个不同的基因区域a、b和c,并设计相应的引物,分别扩增出约645、609和615 bp的靶基因,分别用pET-28a表达载体进行重组后,获得pET-28a-NS3a、pET-28a-NS3b与pET-28a-NS3c,用表达菌株BL21(DE3)进行表达,b段表达较高,可溶性表达较好,纯化后,可获得重组蛋白CSFV-His-NS3b, SDS-PAGE验证表达的重组蛋白大小约为27 kD,Western-Blot证实其具有良好的免疫原性,并且通过ELISA测得蛋白浓度约5 mg/mL,表明该蛋白特异性很强,可用于猪瘟诊断试剂盒的开发应用。

猪瘟病毒NS3丝氨酸蛋白酶功能区基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

用RT PCR方法扩增分别获得了中国猪瘟病毒强毒石门株和兔化弱毒株非结构蛋白NS3丝氨酸蛋白酶功能区 [即NS3 (ΔC) ]基因cDNA ,将之克隆到 pGEMT载体测定其核苷酸序列 ,并推导出其对应氨基酸序列 ,结果表明这两个毒株间的NS3 (ΔC)区基因核苷酸序列同源性为95 8% ,氨基酸序列同源性为 99% ,有 2个残基的差异 ;两毒株与一些猪瘟病毒以及同属的牛病毒性腹泻病病毒代表毒株的对应序列进行比较 ,所测核苷酸序列及推导的氨基酸序列均极为保守 ,而且氨基酸序列分析结果还表明 ,瘟病毒NS3 (ΔC)序列也含有与其它黄病毒同样保守的由His,Asp和Ser残基构成的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶催化三分体 ,三分体中Ser为丝氨酸蛋白酶催化活性关键氨基酸残基 ;将上述NS3 (ΔC)基因亚克隆至原核表达载体pET 2 8a中 ,并在E .coli中获得高效表达 ,将表达产物纯化并免疫小鼠 ,间接免疫荧光和Westernblot结果表明制备了针对NS3(ΔC)蛋白的多克隆抗体。上述实验结果为继续深入研究非结构蛋白NS3在猪瘟病毒的复制及病毒与宿主细胞相互关系中的作用 。

丙型肝炎病毒非结构蛋白 NS3反式激活研究进展

丙型肝炎病毒非结构区3(HCV NS3)基因位于HCV基因组非结构区3420-5312核苷酸区段.HCV NS3具有多种潜在生物学功能,如蛋白酶、解旋酶活性,介导细胞免疫反应、反式激活端粒酶、调节p53活性及参与蛋白激酶A和STAT信号转导等[1,2],从而影响宿主细胞功能,导致细胞增生、凋亡,甚至癌变.对于NS3蛋白反式激活作用研究,可为进一步研究HCV致病(癌)的分子生物学机制和探索新的丙型肝炎治疗技术提供帮助.

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3与乙型肝炎病毒X蛋白协同反式激活作用的研究

构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白 3(NS3)的重组表达质粒pcDNA3 1(- ) NS3和表达乙型肝炎病毒 (HBV)X蛋白的重组质粒pcDNA3 1(- ) X ,分别瞬时转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞 ,用免疫印记 (Westernblotting)方法鉴定病毒基因的表达。两个表达质粒分别及同时与报告质粒pCAT3 promoter共转染HepG2细胞 ,检测报告基因氯霉素乙酰转移酶 (CAT)的表达水平 ,酶的活性反映了表达的肝炎病毒蛋白对SV4 0病毒早期启动子功能的影响。结果显示 ,两个重组表达载体pcDNA3 1(- ) NS3及pcDNA3 1(- ) X在HepG2细胞均能瞬时表达相应的肝炎病毒蛋白 ;单独共转染实验中 pcDNA3 1(- ) NS3、pcDNA3 1(- ) X组的CAT的表达分别是对照的 3 5倍和 4 4倍 ,两种质粒共同转染时酶的表达是对照的 8 5倍 ;表达质粒对CAT酶表达的激活作用呈剂量依赖性。研究表明 ,HepG2细胞中表达的HCVNS3蛋白和HBVX蛋白均具有反式激活SV4 0早期启动子的功能 ,并且两种蛋白的反式激活功能具有协同特性。本实验有助于解释HCV、HBV感染 ,尤其是共同感染的致病 (癌 )

酵母双杂交技术筛选克隆丙型肝炎病毒NS3结合蛋白基因

为克隆与丙型肝炎病毒 (HCV)NS3蛋白结合的肝细胞中的蛋白基因 ,采用酵母双杂交系统Ⅲ技术进行筛选。构建HCVNS3蛋白诱饵酵母质粒 ,转化酵母AH10 9后与含文库质粒的酵母Y187进行配合 ,在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选。选择既能在 4重营养缺陷培养基(SD/ Trp Leu Ade His)上生长 ,又能在涂有X α 半乳糖(X α gal)的四缺培养平皿上生长的蓝色菌落 ,提取此酵母克隆的质粒 ,转化大肠杆菌后进行测序 ,并进行生物信息学分析。分析的结果显示 ,筛选出 19个阳性克隆 ,包括已知功能基因 17个 ,还有 1个克隆的测序结果与GenBank中的 1个未知功能序列有 4 4 %的同源性 ,初步证明了此基因与HCVNS3有结合活性。说明成功克隆了HCVNS3蛋白结合蛋白基因 ,为以后研究此基因在HCV致病机制以及在肝细胞中的生理功能提供了线索。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活SV40病毒早期启动子的研究

聚合酶链反应(PCR)扩增丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白NS3基因 ,克隆至真核表达载体pcDNA3 1(- )中 ,构建HCV NS3基因真核表达载体 pcDNA3 1(- ) NS3;以该质粒转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞 ,免疫印迹方法 (Westernblotting)检测转染细胞中HCVNS3蛋白的瞬时表达 ;与报告质粒pCAT3 promoter共转染HepG2细胞 ,用酶联免疫吸附方法 (ELISA)检测细胞中氯霉素乙酰转移酶 (CAT)的表达活性。结果显示 ,质粒pcDNA3 1(- ) NS3在HepG2细胞瞬时表达HCVNS3蛋白 ,共转染实验中pcDNA3 1(- ) NS3组的CAT表达活性是空质粒对照组的 4 6倍。表明构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白 ,并能够反式激活SV4 0病毒早期启动子。本研究为进一步克隆HCVNS3蛋白反式激活的靶基因 。

丙型肝炎病毒NS3螺旋酶寡核苷酸适配子的筛选与鉴定

为筛选和鉴定抗丙型肝炎病毒(HCV) NS3螺旋酶(NS3h) 的寡核苷酸适配子(aptamers). 利用SELEX技术,以HCV NS3h为靶分子,从体外合成的81 bp随机单链DNA文库中筛选与HCV NS3h特异结合的寡核苷酸适配子. 克隆测序后,进行了解离常数(Kd) 测定和Clustal W软件包分析适配子一级结构. 经过8轮循环筛选,随机ssDNA库与HCV NS3h的结合率从0.45%上升到29.5%. 所有的一级结构没有共同的同源序列,但可分5个家族,其中4个家族具有共同的保守序列. 解离常数测定表明,寡核苷酸适配子H2与HCV NS3h特异结合的亲和力最高,Kd值为140 nmol/L. 适配子H2 (10 μmol/L)在体外对HCV NS3h的活性具有一定的抑制作用,抑制率达44%. 利用随机寡核苷酸文库获得了抗HCV NS3h的寡核苷酸适配子.

抗猪瘟病毒NS3(p80)蛋白单克隆抗体的制备及其特性鉴定

在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达猪瘟病毒石门株NS3基因部分功能片段,以纯化的重组NS3(p80)蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经间接ELISA筛选及3次连续克隆化获得了4株可分泌抗NS3单抗的杂交瘤细胞(2G7,2F11,5D2和6F11),通过小鼠体内诱生法制备腹水,并对杂交瘤细胞和单克隆抗体的特性进行鉴定。结果表明,杂交瘤细胞染色体正常,抗体分泌稳定,单抗效价高,亲和力各不相同,Ig亚类鉴定均为IgG1。Westernblot分析证明4株单抗均能与原核表达的NS3蛋白特异性结合,6F11株与真核表达的NS3蛋白有较强的特异性反应。

牛病毒性腹泻病病毒NS3表位串联蛋白表达及抗体间接ELISA方法的建立

为建立一种有效的牛病毒性腹泻病病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)抗体检测方法,作者将BVDVNS3蛋白2个抗原表位的编码核酸序列进行串联,构建重组表达载体pET-30a-EXnN,并在原核表达系统中表达了重组蛋白。选取包含12个表位肽的重组蛋白(r-BVDV-EX6N)作为包被抗原建立NS3蛋白抗体间接ELISA方法。该方法的特异性和稳定性良好,与2种商品化试剂盒的符合率分别为96.05%和78.95%。试验结果表明建立的ELISA方法可用于BVDV NS3蛋白抗体的检测。

丙型肝炎病毒NS3蛋白促进人源肝细胞的增殖及其相关机制研究

丙型肝炎病毒(HCV)NS3蛋白与肝癌细胞(HCC)的发生密切相关,但其机制尚不清楚.既往体外研究极少采用HCV的自然宿主细胞——人肝细胞作为研究体系,故所获研究结果有待进一步探讨和证实.构建了表达HCVNS3蛋白的真核质粒,通过稳定转染人源永生化肝细胞系QSG7701,建立了稳定表达HCVNS3蛋白的人源永生化肝细胞系QSG7701/NS3,以此为实验平台,检测了细胞增殖的变化,丝裂原蛋白激酶(MAPK)通路激酶磷酸化水平的改变及转录因子AP-1、NF-κB和STAT3的活性变化.结果表明:HCVNS3蛋白可促进人源永生化肝细胞QSG7701的增殖,HCVNS3蛋白激活ERKs/AP-1可能是其促进细胞增殖的重要机制,并通过上调转录因子NF-κB和STAT3的活性,诱导宿主细胞急性炎症损伤.

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活基因1的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交技术 (SSH )及生物信息学技术 (bioinformatics)筛选并克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白 3(NS3 )反式激活新型靶基因 ,进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 以HCVNS3蛋白表达质粒pcDNA3 1(-) NS3转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1(-)为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术 ,结合生物信息学技术 ,克隆HCVNS3反式激活作用的新的靶基因。结果 对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序证实 ,因其可以被NS3蛋白反式激活 ,故命名为NS3TP1,已在GenBank中注册 ,注册号为AY116969。NS3TP1基因的编码序列全长为 193 2个核苷酸 (nt) ,编码产物由 64 2个氨基酸残基 (aa)组成。结论 HCVNS3是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白 ,HCVNS3反式激活作用的新靶基因的发现 。

应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活的相关基因

目的:应用抑制性消减杂交技术(SSH)构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式激活的相关基因cDNA消减文库,克隆HCV NS3反式激活相关基因。方法:以HCV NS3表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果:文库扩增后得到70个白色克隆,经菌落PCR分析,得到56个200-1000 b插入片段。对所得片段测序,并进行同源性分析,获得6个差异表达的未知序列,可能是NS3反式激活的新的靶基因。结论:成功构建HCV NS3反式激活的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定基础。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活基因2的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交技术 (SSH)及生物信息学技术 (bioinformatics)筛选并克隆丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白3 (NS3 )反式激活新型靶基因 ,进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 以HCVNS3蛋白表达质粒pcDNA3 1(-) NS3转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1(-)为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术 ,结合生物信息学技术 ,克隆HCVNS3反式激活作用的新的靶基因。结果 对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段 ,从HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序证实 ,因其可以被NS3蛋白反式激活 ,故命名为NS3TP2 ,在GenBank中注册 ,注册号为AY116970。NS3TP2基因的编码序列全长为 12 99个核苷酸 (nt) ,编码产物由43 2个氨基酸残基 (aa)组成。结论 HCVNS3是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白 ,而抑制性消减杂交 (SSH)是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术。通过这种技术 ,发现了HCVNS3反式激活作用的新的靶基因 ,这一发现 ,为进一步研究HCVNS3蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。

丙型肝炎病毒融合抗原基因NS3CE对番茄的遗传转化

丙型肝炎病毒是危害人类健康重要的病源之一 ,研制安全、经济、有效和易于推广使用的抗病毒疫苗是预防和控制 HCV的有效手段。本实验用 PCR方法克隆了 HCV中能够产生中和性抗体、具有很好免疫原性的非结构 N S3区基因片段及核心抗原 CE基因片段 ,并在两段基因之间加入连接肽 SPGS的密码子序列 ,构建成融合抗原基因 N S3- CE。将该融合基因连接到载体 p BI12 1上 ,构建植物表达载体 p BINS3CE。通过根癌农杆菌 EHA10 5介导获得转基因番茄。并进行了 PCR扩增、Southern杂交及 RT- PCR等分子检测 ,结果证明外源基因已整合到转基因番茄的基因组中 ,并在转录水平得到表达。

不同基因型丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3对端粒酶活性的研究

目的:建立丙型肝炎病毒(HCV)NS3蛋白细胞表达模型,研究不同基因型丙型肝炎病毒端粒酶活性之间是否存在差异。方法:筛选出不同HCV基因型。分别运用PCR法扩增HCV NS3蛋白基因,转载真核表达载体pBK-CMV,构建重组质粒pBK-HCV NS3,分别导入肝癌细胞株HepG2,采用端粒重复序列扩增(TRAP)方法检测不同基因型HCV NS3蛋白基因转载质粒导入HepG2细胞的端粒酶活性。结果:本地区HCV基因型流行的主要是1b型,其次是2a型。转染不同基因型HCV NS3蛋白基因的HepG2细胞端粒酶活性较转染空载质粒的细胞明显升高;不同基因型HCV端粒酶活性之间存在差异,HCV 1b型的端粒酶活性明显高于HCV 2a型。结论:HCV NS3蛋白可能以某种机制激活了端粒酶活性。不同基因型HCV NS3蛋白在细胞恶性转化中的影响有差异。

慢性丙型肝炎患者NS3/4A蛋白酶抑制剂预存耐药的临床研究

【目的】了解我国华南地区从未接受任何抗病毒治疗的慢性丙型肝炎(慢丙肝)患者NS3/4A蛋白酶抑制剂相关耐药位点的流行情况、临床特点包括其对干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗的影响。【方法】在接受抗病毒治疗前对183例慢丙肝患者的NS3/4A蛋白酶抑制剂相关的耐药位点采用自行设计型别特异性引物行巢式PCR,PCR产物纯化后直接测序法鉴定,有变异的患者为变异组(125例),无变异的患者为野生组(37例),对两组患者的临床资料包括干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗后的持续病毒应答率等进行分析。【结果】183例患者中162例患者样本的NS3区扩增成功,其中125例(77.16%)患者检出耐药相关的变异位点266个,其中HCV 1b型A156S变异率为18.33%(11/60),T54S为5.00%(3/60);HCV 2a型V36L变异率为100.00%(14/14),A156S为64.29%(9/14);HCV 6a型Q80K变异率为95.45%(84/88),V36L为4.55%(4/88),D168E为2.27%(2/88),变异组患者经干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗后的持续病毒性应答率为81.60%(102/125),而野生组的为81.03%(30/37),两者比较无明显差异(P=0.943)。【结论】我国不同基因型的慢丙肝患者对NS3/4A蛋白酶抑制剂存在不同的预存耐药,耐药变异对慢丙肝患者疾病状态包括干扰素联合利巴韦林的疗效无影响。预存耐药的存在警示我们未来在使用此类药物时需分析病毒基因型及预存耐药变异情况,从而为患者提供最好的病毒学监测及最优的治疗方案。