基于荧光法及分子对接研究黄褐毛忍冬抑制丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶活性

目的基于荧光实验及分子对接研究黄褐毛忍冬抗丙型肝炎病毒(HCV)NS3/4A蛋白酶的活性。方法采用荧光法测试黄褐毛忍冬提取物抑制HCV NS3/4A蛋白酶活性,分子对接分析主要活性成分与HCV NS3/4A病毒蛋白酶结合情况。结果黄褐毛忍冬水提物、醇提物能较好的抑制HCV NS3/4A蛋白酶活性,半数抑制浓度(IC_(50))为0.005~0.019 mg/ml。分子对接和相互作用分析发现绿原酸、异绿原酸A、木犀草苷、木犀草素与HCV NS3/4A蛋白酶结合较好,可形成多个氢键。结论初步明确异绿原酸A和木犀草素是黄褐毛忍冬抗HCV NS3/4A蛋白酶活性的有效成分。

基于Au-g-C_(3)N_(4)NS纳米复合材料的分子印迹电化学发光传感器检测叶酸

近年来,作为一种新型的二维半导体纳米材料,石墨相氮化碳纳米薄片(g-C_(3)N_(4)NS)因其优异的电化学发光(ECL)性能和良好的成膜特性在ECL传感领域备受关注。然而,g-C_(3)N_(4)NS在较高的工作电压下产生的ECL信号不稳定,而金纳米粒子(Au NPs)的引入可明显改善其发光稳定性.基于这个特点,采用原位生长法将Au NPs引入g-C_(3)N_(4)NS中,制备了一种金-石墨相氮化碳纳米复合材料(Au-g-C_(3)N_(4)NS),以其作为ECL物质固定在电极上.同时,引入具有专一识别能力的分子印迹聚合物(MIP),构建了一种检测叶酸(FA)的分子印迹-电化学发光(MIP-ECL)传感器.该传感器对FA表现出良好的选择性和灵敏响应,在优化的条件下,信号变化与FA物质的量浓度在1.0×10^(-10)~1.0×10^(-3) mol·L^(-1)的范围内呈良好的线性关系,检出限(LOD)达到0.07 nmol·L^(-1).并且探讨了检测机理,考察了传感器的稳定性和重现性,将传感器用于实际样品中FA的检测,获得满意结果.

慢性丙型肝炎患者NS3/4A蛋白酶抑制剂预存耐药的临床研究

【目的】了解我国华南地区从未接受任何抗病毒治疗的慢性丙型肝炎(慢丙肝)患者NS3/4A蛋白酶抑制剂相关耐药位点的流行情况、临床特点包括其对干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗的影响。【方法】在接受抗病毒治疗前对183例慢丙肝患者的NS3/4A蛋白酶抑制剂相关的耐药位点采用自行设计型别特异性引物行巢式PCR,PCR产物纯化后直接测序法鉴定,有变异的患者为变异组(125例),无变异的患者为野生组(37例),对两组患者的临床资料包括干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗后的持续病毒应答率等进行分析。【结果】183例患者中162例患者样本的NS3区扩增成功,其中125例(77.16%)患者检出耐药相关的变异位点266个,其中HCV 1b型A156S变异率为18.33%(11/60),T54S为5.00%(3/60);HCV 2a型V36L变异率为100.00%(14/14),A156S为64.29%(9/14);HCV 6a型Q80K变异率为95.45%(84/88),V36L为4.55%(4/88),D168E为2.27%(2/88),变异组患者经干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗后的持续病毒性应答率为81.60%(102/125),而野生组的为81.03%(30/37),两者比较无明显差异(P=0.943)。【结论】我国不同基因型的慢丙肝患者对NS3/4A蛋白酶抑制剂存在不同的预存耐药,耐药变异对慢丙肝患者疾病状态包括干扰素联合利巴韦林的疗效无影响。预存耐药的存在警示我们未来在使用此类药物时需分析病毒基因型及预存耐药变异情况,从而为患者提供最好的病毒学监测及最优的治疗方案。

民族药野梦花基源及提取物抗丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶活性研究

目的研究民族药野梦花基源及提取物体外抗丙型肝炎病毒(HCV NS3/4A)蛋白酶活性。方法采用生药学常用鉴别方法确定野梦花基源,利用系统溶剂萃取法提取和初步分离野梦花,经荧光法测试野梦花提取物抗HCV NS3/4A蛋白酶活性。结果野梦花为瑞香科植物(Daphne papyracea Wall.ex Steud.var.crassiuscula Rehd.),其乙酸乙酯和正丁醇提取物,在浓度为100μg.ml-1时,对HCV NS3/4A蛋白酶的抑制率分别为70.5%和65.4%。结论民族药野梦花的乙酸乙酯和正丁醇部位为抗HCV NS3/4A蛋白酶的有效部位。

HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶和NS5B RNA聚合酶抑制剂的临床研究进展

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)NS3/4A丝氨酸蛋白酶和NS5B RNA依赖的RNA聚合酶是病毒蛋白前体加工成熟和复制过程中十分重要的两个酶,是抗HCV治疗的理想靶点.近年来,关于HCV NS3/4A蛋白酶和NS5B RNA聚合酶抑制剂的研究是抗HCV研究最为活跃的方向,本文综述了他们在临床试验中的最新研究进展.

HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶在大肠杆菌中表达、纯化

在大肠杆菌中HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶获得表达并进行纯化。根据NS3与NS4A两者形成异源二聚体的结构要求,并参照文献,通过基因拼接的方法设计了单链NS3/4A丝氨酸蛋白酶的基因。合成相应引物,利用反转录PCR从HCV患者血液中扩增出该蛋白酶的编码基因,克隆入原核表达载体pRSET-A,将重组表达质粒pRSET-A-ns3/4a转化BL211(DE3)大肠杆菌,并诱导表达与纯化。成功地构建了重组表达质粒pRSET-A-ns3/4a;重组质粒转化的BL21工程菌经IPTG诱导表达后,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot证实为NS3/4A丝氨酸蛋白酶,并用镍离子亲和层析方法获得纯化蛋白酶。获得的纯化NS3/4A丝氨酸蛋白酶为建立其酶活性测定系统奠定了基础。

丙型肝炎病毒NS3/4A丝氨酸蛋白酶瞬时表达小鼠模型的建立

目的:建立丙型肝炎病毒NS3/4A丝氨酸蛋白酶体内活性评价模型。方法:利用NS4A/B是NS3/4A丝氨酸蛋白酶作用底物的特性,构建融合基因NS3/NS4A/B-SEAP,底物片段NS4A/B插在NS3/4A和人分泌性碱性磷酸酶(SEAP)之间,融合基因表达后SEAP的分泌依赖于有活性的NS3/4A在NS4A/B位点的切割。将含融合基因的质粒NS3/4A(△4AB)SEAP通过水动力转染技术转染到小鼠体内,检测小鼠血清中SEAP的活性,高活性的SEAP是该评价体系成立的证据。结果与结论:在瞬时表达NS3/4A的小鼠血清中检测到了高活性的SEAP,建立了可用于评价抗NS3/4A的小鼠体内瞬时模型。

Tet-on和Cre/loxP系统双重调控表达丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶三转基因小鼠的建立

目的:建立Tet-On调控系统和Cre/loxP基因剔除系统双重调控表达丙型肝炎病毒(HCV)NS3/4A丝氨酸蛋白酶三转基因小鼠。方法:选择适龄并经鉴定的在Tet-on系统调控下肝脏特异性表达Cre重组酶的双转基因小鼠Lap/LC-1与在Tet-on系统调控下肝脏特异性表达萤光素酶(Luc)的双转基因小鼠Lap/NS3/4A交配,子代小鼠经PCR检测、筛选基因组中NS3/4A、Lap、LC-1等3个转基因片段均阳性的小鼠。三阳性的NS3/4A/Lap/LC-1小鼠经多西环素(Dox)诱导1周后,以在体生物发光成像系统(BLI)检测报告基因Luc的表达,免疫组化检测小鼠体内Cre重组酶、HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的表达状况。结果:NS3/4A/Lap/LC-1小鼠经Dox诱导后,BLI结果显示仅在小鼠肝脏部位有强烈的发光信号,表明这些小鼠肝细胞内报告基因Luc特异高效表达;免疫组化结果证实Cre重组酶、NS3/4A蛋白酶仅在经诱导后的小鼠肝细胞中特异性表达。结论:建立了Tet-On调控系统和Cre/loxP基因剔除系统双重调控下表达HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的三转基因小鼠模型,为进一步研究HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶在HCV感染后与宿主相互作用的机制,以及抗NS3/4A丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂的筛选奠定了基础。

酶联免疫吸附试验检测HCV NS3-4A蛋白酶活性

目的 建立一种检测丙型肝炎病毒 (HCV) NS3- 4A丝氨酸蛋白酶的酶联免疫吸附试验 (EL ISA)方法 ,用于筛选 HCV蛋白酶抑制剂。方法 将质粒 p MAL- c2 / NS3- 4A转化到大肠杆菌 K1 2 TB1 中 ,经 IPTG诱导表达 ,亲和层析柱纯化后得到麦芽糖结合的 NS3/ NS3- 4A融合蛋白 ,用 Western blot分析其免疫学活性 ,并以酶联免疫吸附试验检测其生物学活性。结果 SDS- PAGE电泳分析并用考马斯亮蓝染色 ,显示相对分子质量 112 0 0 0和116 0 0 0处有麦芽糖结合的 NS3及 NS3- 4A融合蛋白带出现 ;Western blot分析表明 ,表达的产物可与抗 NS3蛋白的单克隆抗体发生阳性反应。EL ISA证实 HCV NS3- 4A蛋白酶能使特异底物裂解。正交实验获得 EL ISA的最佳实验条件 ,其 P/ N值为 3.6 3,批内和批间变异系数 (CV)分别为 4.16 %和 7.5 2 %。此方法测定 1,4萘醌对 HCV蛋白酶活性 5 0 %抑制浓度 (IC5 0 )为 8.36 μm ol/ L。结论 建立的 EL ISA方法 ,用于测定 HCV蛋白酶活性 ,具有简便、快速、重复性好等特点 ,为以 HCV NS3- 4A蛋白酶为靶酶的抑制剂筛选及抗 HCV药物的研究奠定了基础。

第二代丙型肝炎病毒NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂研究进展

本文综述了近年来基于特拉匹韦(telaprevir)、波西匹韦(boceprevir)和BILN-2061等第一代HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂的第二代抑制剂的结构改造。第二代抑制剂可有效提高抑制效力,显著改善药代动力学参数,可在一定程度上克服由第一代抑制剂诱导产生的耐药性。同时探讨了各类抑制剂的构效关系。

HPLC同时测定山辣子皮中3种抗HCV NS3/4A蛋白酶香豆素的含量

目的:建立HPLC同时测定山辣子皮中3种抗HCV NS3/4A蛋白酶香豆素(瑞香素、瑞香新素、7-羟基-8-甲氧基香豆素)的含量。方法:采用Waters symmetry shield^(TM)RP 18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);以甲醇-0.1%甲酸溶液为流动相进行梯度洗脱;流速1.0 mL/min;柱温35℃;检测波长322 nm;进样量:10μL。结果:3种成分的分离度良好,瑞香素、瑞香新素、7-羟基-8-甲氧基香豆素分别在8.22~164.40μg/mL(r_1=0.9999)、1.44~28.80μg/mL(r_2=0.9999)和0.77~15.52μg/mL(r_3=0.9999)浓度范围内呈良好的线性关系,平均加样回收率分别为102.66%(RSD=0.31%)、100.46%(RSD=0.74%)和102.39%(RSD=0.63%)。结论:该结果表明建立的方法简单,稳定性和重复性好,可用于山辣子皮的质量控制。

丙型肝炎病毒NS4B蛋白调控Hep3B细胞非折叠蛋白质反应研究

研究表达的丙型肝炎病毒(HCV)NS4B对Hep3B细胞非折叠蛋白质反应的影响。NS4B重组真核表达质粒pcDNA3.1(-)NS4B通过脂质体转染Hep3B细胞,G418筛选和Western blot鉴定稳定转染细胞;RT-PCR检测稳定转染细胞内XBP1 mRNA剪接,Western blot鉴定ATF6蛋白切割,荧光素酶试验检测稳定转染细胞内GRP78和XBP1启动子活性。G418筛选和Western Blot鉴定证实获得稳定表达NS4B的Hep3B细胞;在该细胞内,XBP1 mRNA剪接、ATF6切割、XBP1和Grp78启动子激活均被检测到。NS4B在Hep3B的稳定表达诱导了非折叠蛋白质反应。

ULBP1启动子报告质粒的构建及NS3/4A蛋白对ULBP1基因转录的作用

目的:构建含有ULBP1基因启动子的报告质粒,并初步研究NS3/4A对ULBP1转录的影响。方法:将ULBP1启动子核心区序列连接在pGL3-enhance载体上构建ULBP1报告质粒pGL3-ULBP1质粒;将HCV的蛋白酶NS3/4A基因亚克隆到pcDNA3-Flag载体上(pcDNA3-Flag-NS3/4A),Western blot检测其表达。用荧光分度计检测NS3/4A对ULBP1转录水平的影响。结果:成功构建了含有ULBP1启动子的报告质粒pGL3-ULBP1和FLAG-NS3/4A真核表达质粒,并检测到NS3/4A可以抑制ULBP1的转录。结论:HCV的蛋白酶NS3/4A可以抑制ULBP1的转录。

活体荧光成像监测HCV NS3/4A蛋白在小鼠体内的瞬时表达

目的建立HCV NS3/4A蛋白酶在小鼠体内可视化表达模型。方法利用水动力转染技术将融合基因NS3/4A-Fluc转染至小鼠肝脏,建立目的基因的瞬时表达模型,通过RT-PCR方法检测目的基因Fluc及NS3/4A的RNA表达水平,以及通过Western blot方法检测目的基因NS3/4A-Fluc的蛋白表达水平。结果建立了通过报告基因Fluc反映HCV NS3/4A蛋白酶的瞬时表达可视化小鼠模型。结论成功建立了可用于评价NS3/4A蛋白酶的可视化小鼠模型。

猪瘟病毒NS3丝氨酸蛋白酶功能区基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

用RT PCR方法扩增分别获得了中国猪瘟病毒强毒石门株和兔化弱毒株非结构蛋白NS3丝氨酸蛋白酶功能区 [即NS3 (ΔC) ]基因cDNA ,将之克隆到 pGEMT载体测定其核苷酸序列 ,并推导出其对应氨基酸序列 ,结果表明这两个毒株间的NS3 (ΔC)区基因核苷酸序列同源性为95 8% ,氨基酸序列同源性为 99% ,有 2个残基的差异 ;两毒株与一些猪瘟病毒以及同属的牛病毒性腹泻病病毒代表毒株的对应序列进行比较 ,所测核苷酸序列及推导的氨基酸序列均极为保守 ,而且氨基酸序列分析结果还表明 ,瘟病毒NS3 (ΔC)序列也含有与其它黄病毒同样保守的由His,Asp和Ser残基构成的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶催化三分体 ,三分体中Ser为丝氨酸蛋白酶催化活性关键氨基酸残基 ;将上述NS3 (ΔC)基因亚克隆至原核表达载体pET 2 8a中 ,并在E .coli中获得高效表达 ,将表达产物纯化并免疫小鼠 ,间接免疫荧光和Westernblot结果表明制备了针对NS3(ΔC)蛋白的多克隆抗体。上述实验结果为继续深入研究非结构蛋白NS3在猪瘟病毒的复制及病毒与宿主细胞相互关系中的作用 。

丙型肝炎病毒NS3-4A蛋白对MMP-9及天然免疫的影响

目的探讨HCV编码的NS3-4A蛋白对MMP-9表达的调节作用。方法利用Primer Premier5.0软件设计相关引物,构建在相应的载体上;使用PCR扩增目的基因;PCR产物以及双酶切产物的胶回收;冷氯化钙法制备感受态细胞;YC法转化感受态细胞;进行细胞培养基的配制;之后进行RT-PCR反应。结果在Huh7.5.1细胞内,内源性的MMP-9可以被NS3-4A蛋白上调表达;转染了p CMV-tag2A-NS3-4A质粒的Huh7.5.1细胞与未转染的细胞相比,其内源性MMP-9的表达可以明显被NS3-4A蛋白上调。在Huh7.5.1细胞中,IFN-α可以增促进MMP-9基因mRNA的表达,且这种增强作用呈现出剂量依赖性;在转染了p CMVtag2B-MMP-9质粒的Huh7.5.1细胞中,其内源性IFN-α及其受体IFNAR1和IFNAR2的表达可以被MMP-9蛋白抑制,且对IFN-α及IFNAR1的抑制作用具有较明显的剂量依赖性;向转染了p CMV-tag2B质粒的Huh7.5.1细胞中加入IFN-α可以上调其内源性的PKR和OAS2的表达,而MMP-9又可以抑制这些基因的表达,这反过来也说明MMP-9可以抑制IFN-α及其受体IFNAR1和IFNAR2的表达,进而抑制IFN-α下游PKR和OAS2的表达;IFN-α可以上调Huh7.5.1细胞中内源性的PKR和OAS2的表达,而MMP-9又可以抑制这些基因的表达,这与之前mRNA水平的检测结果相一致。结论在HCV的感染过程中,NS3-4A蛋白可以促进细胞内源性IFN-α的表达,而IFN-α的高表达又会导致MMP-9的高表达,MMP-9反过来又会抑制IFN-α及其受体IFNAR1和IFNAR2的表达水平,进而抑制IFN-α下游的PKR及OAS2基因。

丙型肝炎病毒NS3蛋白酶的研究进展

丙型肝炎病毒感染常呈慢性化 ,且易使病情进一步发展为肝硬化和肝细胞癌。其基因的多变性使得疫苗研究进展缓慢 ,鉴于NS3蛋白酶在病毒体的成熟和复制中所起的重要作用 ,阐明结构和功能 。

HCV NS3丝氨酸蛋白酶及以其为靶位的抗感染研究进展

丙型肝炎病毒感染最显著的特征是慢性化,已经成为严重的社会公共卫生问题。目前治疗方法仅限于干扰素-利巴韦林联合使用,持续疗效有限而且副作用大,因此迫切需要寻找特异有效的抗病毒药物。HCVNS3基因编码的NS3蛋白具有丝氨酸蛋白水解酶、解旋酶和磷酸核苷酶活性,在病毒RNA复制和多聚蛋白前体的加工成熟中有着重要作用。因此,NS3丝氨酸蛋白酶的抑制剂是抗病毒的理想药物。本文就HCVNS3丝氨酸蛋白酶及以其为靶位的抗感染研究综述如下。

黄病毒非结构蛋白NS3的蛋白酶特性研究进展

黄病毒科成员多,且其基因组结构同源性高,弄清其结构与功能的关系可大大缩短疫苗研制和使用的进程。黄病毒NS3蛋白为分子量仅次于NS5的非结构蛋白,且具高度保守性。实验表明,NS3蛋白具蛋白酶活性。本文就NS3蛋白的酶活性中心、辅酶成分、底物结合部位及酶特异作用序列等加以阐明。