用内转录间隔区通用引物的聚合酶链反应快速测定念珠菌菌种

目的:应用内转录间隔区(ITS)通用引物建立一种较为快速、简便的检测和鉴定念珠菌的聚合酶链反应(PCR)方法。方法:采用两对ITS通用引物ITS1、ITS4和ITS86、ITS4对7种(8株)念珠菌菌悬液进行PCR扩增。结果:两对引物3.5h内对7种念珠菌的菌悬液扩增出种特异的DNA条带,而第2对引物其种特异性更强。结论:采用ITS通用引物结合快速PCR检测法,可快速、简便、特异、敏感地检测出念珠菌,并能同时鉴定到种,这将在今后念珠菌病的早期诊断和治疗上有潜在的应用价值。

聚合酶链反应检测心肌炎石蜡包埋组织柯萨奇病毒B_3 RNA

报道从心肌炎石蜡包埋组织单一切片(6～8μm)中提取RNA,使用定位于柯萨奇病毒B_3特异编码区(VP_1)的一对引物、通过聚合酶链反应(PCR)进行基因扩增。对PCR扩增产物,采用3′末端生物素标记的柯萨奇病毒B_3的特异寡核苷酸探针进行斑点杂交。结果表明,两例检查的心肌炎标本都是柯萨奇病毒B_3感染引起的病毒性心肌炎。本实验说明,从石蜡包埋的组织标本中提取RNA,进行PCR检测是可行的,为临床病理进行分子生物学研究开辟了一条新途径。

聚合链酶反应对海南疟区儿童带疟原虫的调查

为了解应用聚合酶链反应（PCR）检测疟区儿童带疟原虫的效果，参照文献合成恶性疟原虫（PF）与间日疟原虫（PV）引物各1对，并改进标本处理方法，按PCR检测操作常规，对采自乐东县的恶性疟与间日拒混合流行区的儿童血标本，分别进行PF与PV的PCR检测，同时以厚血膜镜检法对照比较。119例儿童血标本检测结果，PCR法与镜检法的带疟原虫率分别为6．72％与5．04％，镜检发现的PF与PV带虫者，PCR皆可拉出，PCR还检出3例镜检未发现的PF带虫者，显示PCR法比显微镜法的敏感性高，特异性强，适用于恶性疟与间日疟混合流行区人群的疟疾调查和监测。

荧光定量聚合酶链反应检测miR-342-3p及靶基因EVL在多发性骨髓瘤细胞中的表达

目的研究多发性骨髓瘤(MM)患者中miR-342-3p及靶基因EVL的表达情况及意义。方法建立应用颈环式结构引物反转录扩增微小RNA(miRNA)的反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法 ,并采用荧光定量聚合酶链反应(RQ-PCR)对miR-342-3p及靶基因EVL的表达进行定量分析。结果①5例MM患者中miR-342-3p相对表达量为7.6±5.7,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。②MM细胞株U266中miR-342-3p相对表达量为7.0±3.2,较对照组表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。③5例MM患者中EVL基因相对表达量为6.3±3.2,较对照组表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。④MM细胞株U266中EVL基因相对表达量为4.3±1.1,较对照组表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 MM存在miR-342-3p及EVL基因表达异常,可能为研究MM发病机制提供思路。

实时逆转录荧光定量聚合酶链反应检测外周血GPC3mRNA在原发性肝癌患者中的表达及意义

目的探讨实时逆转录荧光定量聚合酶链反应(RealtimeQRT-PCR)检检测外周血磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 mRNA(GPC3 mRNA)在原发性肝癌(HCC)患者中的表达意义。方法采用Realtime QRT-PCR技术分别检测37例HCC、21例转移性肝癌、22例肝硬化患者和35例体检健康志愿者外周血中GPC3 mRNA的水平。结果 HCC患者外周血GPC3mRNA的阳性率为91.8%(34/37),表达水平为(1.5±0.9)×106copies/ml;转移性肝癌外周血GPC3 mRNA的阳性率为4.7%(1/21),表达水平为5.2×103copies/ml;肝硬化患者GPC3 mRNA的阳性率为4.5%(1/22),表达水平为2.6×103 copies/ml;体检健康志愿者外周血GPC3 mRNA无阳性表达。HCC患者手术前后血液中GPC3 mRNA的阳性率差异无统计学意义(P<0.05),但两者表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Realtime QRT-PCR检测外周血GPC3 mRNA是诊断早期HCC血微转移可行的实验方法。

用聚合酶链反应制备抗端粒酶蛋白重链和轻链可变区基因

目的：为了制备抗端粒酶蛋白hTERT可变区基因。方法：采用Ni-NTA树脂层析法从PBKTRT转染的 E.coli JM109阳性菌中分离纯化端粒酶蛋白hTERT，并免疫小鼠。从免疫的小鼠脾脏中提取淋巴细胞中总RNA，逆转录成cDNA，以逆转录合成的cDNA第一条链为模板，分别用VH和VL引物，通过PCR进行扩增。结果：PCR扩增反应产生350bp大小的抗hTERT重链和轻链可变区基因。VH和VL基因片段的获得为进一步制备抗hTERT单功能区抗体（dABs）和单链抗体ScFv奠定了实验基础。结论：提示该方法具有稳定性好，易于重复，扩增后VH和VL量较高的优点。

实时定量聚合酶链反应检测前列腺癌抗原3方法的建立

目的建立检测前列腺癌抗原3（PCA3）基因的实时定量聚合酶链反应（PCR）方法。方法应用反转录一PCR扩增PCA3后，通过琼脂糖凝胶电泳和基因测序进行鉴定。应用SYBRGreen实时荧光定量PCR检测PCA3和建立相应的标准曲线，使用熔解曲线分析扩增产物的特异性。同时在临床标本中验证所建立的PCA3检测方法的效能。结果琼脂糖凝胶电泳和基因测序均提示扩增产物是特异性的。建立的检测PCA3的SYBRGreen实时荧光定量PCR方法的线性检测范围为1×10^1～1×10^-7拷贝，扩增效率为98％，决定系数为0．999。熔解曲线仅见单一的峰，证实扩增产物是特异性的。该方法的日内和日间变异系数分别为2．1％和2．7％。利用所建立的PCA3检测方法分析86例前列腺癌患者和45例非前列腺癌患者尿液中的PCA3表达水平，结果表明PCA3早期诊断前列腺癌的性能显著优于血清前列腺特异性抗原（PSA）。结论建立了一种快速、灵敏、高特异性、宽定量范围和高重复性检测PCA3的实时定量PCR方法。

聚合酶链反应扩增人动脉粥样硬化抗体全套可变区基因

目的利用二次聚合酶链反应(PCR)扩增人动脉粥样硬化抗体全套可变区基因,并将其克隆到T载体进行测序验证。方法收集50例动脉粥样硬化患者外周动脉血标本,密度梯度离心法分离淋巴细胞,TR Izol法提取总RNA,用逆转录-PCR扩增轻链可变区基因(包括VK和Vλ)和重链可变区基因(VH),分别酶切后克隆到T载体上,随机挑取2个克隆进行测序验证。结果总RNA的纯度和完整性都较好,经过2次PCR成功扩增出了抗体全套轻、重链可变区基因。测序结果与已有的人抗体基因的序列高度同源。结论该方法成功扩增出了人动脉粥样硬化抗体全套可变区基因,为下一步噬菌体单链抗体库的构建和筛选奠定了基础。

重叠延伸聚合酶链反应克隆大鼠Foxo3a基因及序列测定

目的获得大鼠Foxo3a基因全长编码区基因。方法运用重叠延伸PCR方法从大鼠脾脏总RNA中扩增Foxo3a编码区基因全长,将其插入pMD19-T载体中进行酶切及测序鉴定。结果Foxo3a编码区基因全长2019bp,与GenBank中大鼠Foxo3a基因同源性为99.9%。结论运用重叠延伸PCR技术可成功克隆高GC含量大鼠Foxo3a的cDNA,为进一步研究该基因奠定了基础。

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测前列腺癌抗原3mRNA表达水平

目的采用SYBR Green I实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,建立检测前列腺癌抗原3(DD3)mRNA的标准,定量检测人体不同组织中该基因的表达水平。方法从LNCaP细胞中采用RT- PCR法扩增特异性DD3基因片段,将其与pMD18-T载体连接,转化宿主菌JM109,对质粒标准进行聚合酶链反应(PCR)检测及测序。纯化后检测质粒拷贝浓度,制备梯度浓度标准品。应用LightCycler荧光定量PCR仪对标准品进行检测。取正常人乳腺组织、膀胱、结肠、尿道、肺、睾丸、精囊、卵巢、正常前列腺组织、前列腺增生及前列腺癌组织,定量检测DD3 mRNA表达。结果建立稳定的检测DD3 mRNA的标准,正常人乳腺、膀胱、结肠、尿道、肺、睾丸、精囊、卵巢中无DD3 mRNA表达,在正常前列腺及前列腺增生组织中低表达,两者间差异无显著性 (P>0．05);在前列腺癌中高表达(P<0．05)。结论应用SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR技术检测 DD3 mRNA表达水平简便、可行、经济。DD3基因的表达具有良好的前列腺癌特异性。

基于杂交链反应的新一代RNA-FISH技术检测EV-A71 RNA及其与病毒3D聚合酶的相互作用

RNA荧光原位杂交(RNA-fluorescence in situ hybridization,RNA-FISH)技术利用荧光标记的核苷酸探针,通过互补链杂交,对细胞或组织中特定的RNA序列进行检测和定位。由于RNA-FISH产生的阳性信号较弱,需要结合特异性信号放大,提高信噪比。但传统信号放大技术的背景难以消除,无法定量且分辨率低,是RNA-FISH技术应用的巨大障碍。本文基于第3代杂交链反应(hybridization chain reaction version 3.0,HCR v3.0),利用一对分裂式探针消除非特异杂交背景,并引发荧光信号放大反应,建立了针对肠道病毒A71(enterovirus-A71,EV-A71)RNA的敏感、特异的FISH检测方法,并将该技术与蛋白免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测结合,通过高分辨率激光共聚焦成像,成功地在单个细胞水平上检测了EV-A71感染细胞后病毒RNA与其聚合酶3D蛋白的分布变化和相互作用情况,并对细胞中病毒RNA和3D蛋白进行定量。发现相较于传统定量方法,如逆转录定量聚合酶链反应和免疫印迹,新一代RNA-FISH技术在单个细胞水平上病毒RNA和3D聚合酶的表达情况与群体细胞检测的结果在趋势上有明显差异。这说明,基于杂交链反应的新一代RNA-FISH技术,可以克服群体细胞数量增减掩盖病毒组分变化的缺点,从而真实反映病毒在单个细胞中的变化。

聚合酶链反应检测肝硬化患者腹水中细菌DNA

目的:探讨PCR方法检测肝硬化患者腹水中细菌DNA的可行性。方法:在细菌16SrRNA基因保守区设计一对通用引物,对7种对照菌株、人基因组DNA、HBVDNA、3 7份肝硬化患者腹水进行聚合酶链反应扩增。结果:7种对照菌株均获得5 3 0bpDNA片段。而与人基因组DNA、HBVDNA无交叉阳性反应,敏感性试验可检测出1pg的细菌DNA。3 7份腹水中有9份获得5 3bpDNA片段,阳性率2 4 3 % (9/3 7) ,而腹水细菌培养阳性率为5 4%(2 /3 7) ,两者比较差异有显著性意义(P <0 0 5 )。结论:将通用引物通过PCR方法扩增细菌16SrRNA基因,具有高度敏感性、特异性,可应用于肝硬化患者腹水中细菌DNA的检测及细菌移位的研究。

SYBR Green实时荧光定量聚合酶链反应宽范围检测人GAPDH基因体系的建立

目的建立一种快速、灵敏的人3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因实时荧光定量-聚合酶链反应（RT-PCR）方法。方法根据GeneBank数据库中提供的人GAPDH基因（NC000012）mRNA序列,在其保守区域设计一对用于RT-PCR引物,通过优化反应体系和反应条件,成功建立了检测人GAPDH基因的SYBR Green RT-PCR方法。结果实验结果表明,该检测方法检测人GAPDH基因的最低检测拷贝数可达到15copies/μL,在一个较宽的浓度范围内（1.5×1011.5×107）具有良好的线性关系（r=0.992）。溶解曲线呈现了清晰的单一峰型,Tm值为（84.5±0.2）℃。结论该研究为人GAPDH基因作为内参基因进行人功能基因与病原基因表达的定量分析提供了一种更为快速、灵敏的方法。

天麻ITS序列的聚合酶链反应扩增

目的:为天麻核糖体DNA中的内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列分析提供可靠、特异的聚合酶链反应(PCR)条件。方法:选择ITS序列通用引物对天麻ITS序列进行PCR扩增,对一系列PCR条件参数进行摸索,同时对PCR产物进行纯化后直接测序。结果:天麻ITS序列PCR扩增产物约为750 bp,不同来源样本存在有一定的差异。经测序后与Genebank中相关序列比对,天麻ITS序列总长度为598 bp,其中ITS1为235 bp,ITS2为209 bp,5.8S为154 bp,G+C(%)为52%。结论:扩增天麻ITS序列的PCR反应条件可以得到可靠、特异的结果。

逆转录-聚合酶链反应快速检测柯萨奇B病毒

在柯萨奇B3病毒RNA5＇端非编码区选择并合成引物，用RT－PCR对我省苍山县23份无菌性脑炎患者的粪便标本进行检测，并与常规病毒分离、培养、鉴定进行了平行比较。两种检测结果基本一致。

聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳分析在毒死蜱胁迫下土壤真菌群落结构演替

为评价毒死蜱施用后对土壤真菌群落结构的影响,将农田土壤用终质量分数5mg/kg毒死蜱处理,同时以不施用毒死蜱为对照,定期采集土样进行毒死蜱残留测定并提取土壤DNA,采用基于染色体内转录间隔区(internaltranscribed spacers,ITS)ITS1f-GC/ITS2和28SrDNA U1-GC/U2引物对进行聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳,获得的指纹图谱利用Quantity One软件进行数字化分析,计算样品的多样性指数(H),并用Matlab软件进行主成分分析.ITS1f-GC/ITS2和U1-GC/U2扩增区域分析结果表明,毒死蜱施用后第7～60天内土壤真菌群落结构与对照相比发生很大改变,且毒死蜱处理样品真菌群落结构保持基本稳定,多样性指数明显提高;主成分分析显示,毒死蜱处理样品与对照明显分在2个不同的区域,充分表明毒死蜱对土壤真菌群落结构影响迅速且持久.

实时荧光定量聚合酶链反应检测在乙型肝炎诊断中的应用

我国是乙型肝炎病毒（HBV）高流行区，50％～70％的人受到感染，8％～10％是HBV携带者，肝炎患者中60％是慢性肝炎患者，HBV又与肝硬化和原发性肝癌密切相关。

逆转录聚合酶链式反应检测胎盘多药赖药基因与胎盘胆汁酸排泌的相关性

目的探讨胎盘多药赖药(MDR3)基因与妊娠期肝内胆汁淤积症(ICP)胎盘胆汁酸排泌的相关性。方法收集妊娠晚期ICP患者(ICP组)和正常晚孕妇女(对照组)各30例,分别采集母体静脉血和新生儿脐静脉血及胎盘组织,采用放射免疫分析方法检测母血及脐血中的甘胆酸(CG)含量;采用逆转录聚合酶链式反应法(RT-PCR)测定两组胎盘组织中多药赖药基因mRNA的相对表达量。结果 (1)ICP组母血、脐血中CG水平均高于对照组(28.86±8.51vs2.70±2.19;19.97±8.80vs5.83±5.06μg/ml),以上差异均有统计学意义(P<0.001);ICP组母血CG含量高于脐血中的含量,两者之间存在正相关(r=0.588);对照组脐血CG含量高于母血中的含量,两者之间无直线关系(r=0.212)。(2)两组胎盘组织中均检测到MDR3基因的mRNA,与对照组相比,ICP组胎盘组织中MDR3基因的mRNA水平下降(3.33±1.03vs6.85±1.26),差异有统计学意义(P<0.001);且MDR3-mRNA相对量与脐血甘胆酸和母血甘胆酸水平呈负相关性(r=-0.627;r=-0.795)。结论 MDR3基因可能参与了胎盘胆汁酸的排泌。