免疫共沉淀联合质谱技术筛选蓝舌病病毒NS4蛋白的互作蛋白

[目的]筛选蓝舌病病毒(Bluetongue virus, BTV)NS4蛋白颉颃干扰素(interferon, IFN)信号通路的内源性互作蛋白,以便进一步研究NS4抑制IFN信号转导的作用机制。[方法]在前期仙台病毒(Sendai virus, SeV)诱导IFN信号通路基因表达研究基础上,利用免疫共沉淀方法从转染NS4融合eGFP标签表达载体pcDNA3.1-NS4-eGFP和pcDNA3.1-eGFP空载体的HEK-293T细胞中钓取NS4互作蛋白,对免疫沉淀物进行SDS-PAGE分析,免疫共沉淀洗脱液进行质谱鉴定及生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR检测候选蛋白的编码基因表达特征。[结果]通过免疫共沉淀及质谱鉴定分析和数据库比对,共获得189个差异表达蛋白。生物信息学分析结果显示,候选蛋白主要参与蛋白转录、翻译、病毒感染及免疫调控。亚细胞定位分析结果显示,差异表达蛋白主要定位于细胞核、细胞质以及胞质-胞核,筛选出4个与BTV NS4蛋白存在互作的候选蛋白:多聚嘧啶束结合蛋白1(PTBP1)、细胞周期依赖性蛋白激酶9(CDK9)、N-端豆蔻酰化酶1(NMT1)和Y盒结合蛋白1(YBX1)。实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,SeV刺激72 h后,试验组PTBP1、NMT1、YBX1、CDK9基因mRNA表达量均显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01)。[结论]BTV NS4蛋白颉颃IFN信号通路与PTBP1、NMT1、YBX1、CDK9蛋白表达上调有关,本试验结果为进一步研究BTV NS4蛋白颉颃宿主天然免疫应答的分子机制提供靶标参考。

BVDV非结构蛋白NS4B的结构分析及其蛋白表达与鉴定

NS4B是牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的非结构蛋白,为研究BVDV在病毒侵染宿主细胞过程中的作用,对ns4b进行了结构分析、表达载体构建及蛋白表达。采用Prot-Param、TExpasy和SignalP-4.1等软件分析NS4B蛋白的氨基酸组成、疏水性和空间结构。根据Genebank上公布的BVDVns4b基因序列设计引物,利用PCR方法获得ns4b基因片段,连接到p3×Flag-CMV10表达载体上,构建重组质粒p3×Flag-CMV10-ns4b,经双酶切与测序鉴定正确后,将p3×FlagCMV10-ns4b转染到HEK-293T细胞中,利用Western blot检测NS4B蛋白的表达。结果表明BVDV NS4B蛋白分子量为38.4 kDa,不存在信号肽,有49个磷酸化位点和6个糖基化位点,是一种主要由α-螺旋和无规则卷曲结构组成的疏水性稳定蛋白。成功构建了重组质粒p3×Flag-CMV10-ns4b,并且p3×Flag-CMV10-ns4b在HEK-293T细胞中成功表达,为今后研究NS4B蛋白在BVDV感染宿主细胞及其免疫逃逸机制奠定了基础。

蓝舌病病毒NS4蛋白原核表达及多克隆抗体制备

【目的】制备蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)NS4蛋白多克隆抗体,为BTV NS 4基因在病毒增殖及颉颃宿主细胞天然免疫应答中的作用研究奠定基础。【方法】构建pCzn1-NS4原核表达载体,经PCR和测序鉴定后将阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达,使用His标签镍柱纯化NS4蛋白,并经SDS-PAGE、Western blotting鉴定。利用NS4蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,经SDS-PAGE和间接ELISA法测定多克隆抗体纯度及效价,以制备的NS4蛋白多克隆抗体为一抗,通过间接免疫荧光试验(IFA)检测BTV感染的BHK-21细胞内NS4蛋白的表达。【结果】成功构建了原核表达质粒pCzn1-NS4,在37℃、IPTG浓度为0.6 mmol/L时诱导8 h获得大量NS4重组蛋白,SDS-PAGE及Western blotting试验结果显示,重组蛋白分子质量约为18 ku,可与兔His-tag抗体发生特异性反应;制备的NS4蛋白多克隆抗体效价在1∶512000以上。经SDS-PAGE和IFA鉴定,制备的BTV NS4多克隆抗体具有良好的纯度,且在BTV感染的BHK-21细胞中能特异性识别病毒表达的NS4蛋白。【结论】本研究利用原核表达的NS4蛋白制备了特异性多克隆抗体,并初步将该多克隆抗体用于NS4蛋白免疫荧光试验研究,为BTV NS 4基因的功能和应用研究提供参考依据。

猪瘟病毒非结构蛋白NS4B与宿主蛋白相互作用的研究进展

猪瘟病毒(CSFV)是一种可感染猪只并引起典型或慢性猪瘟(CSF)的单链RNA包膜病毒,严重影响动物的健康和养猪业的经济发展。CSFV自身编码的结构蛋白和非结构蛋白可与宿主蛋白相互作用,促进病毒自身的复制、翻译和增殖,并影响病毒毒力和免疫反应等。CSFV的非结构蛋白NS4B在病毒生命周期中发挥重要作用,其自身结构上含有多种特定区域靶点,可与多种蛋白发生相互作用;其作为CSFV复制体碳价结构最重要的组成部分,还可被非结构蛋白NS3切割,在细胞内与CSFV自身蛋白或其他宿主蛋白,如核糖体蛋白侧柄亚基P1(RPLP1)、铁蛋白重链(FHC)、Rab蛋白22a(Rab22a)、脂肪酸合成酶(FASN)、线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)、肿瘤易感基因101(Tsg101)蛋白和猪指环蛋白114(pRNF114)等相互作用。本文对CSFV非结构蛋白NS4B的结构功能以及与宿主蛋白发生相互作用的研究进展进行概述,以期为CSFV致病机理研究和感染防控提供理论帮助。

HCV NS4基因在大肠杆菌中表达及蛋白质提纯

应用 PCR方法扩增出人丙型肝炎病毒全长 N S4基因的 DNA片段 ,克隆入表达载体 p QE3 2并转化E.coli JM10 9,经 IPTG诱导表达出 4 2× 10 3蛋白 .利用 Ni- NTA- agarose纯化得到纯化产物 ,Western- blot鉴定该蛋白能够与抗 NS4的单克隆抗体发生特异性反应 .

溶解氧对X80管线钢在NS4溶液中腐蚀行为的影响

采用动电位极化和交流阻抗技术研究了NS4溶液中的溶解氧对X80管线钢在该溶液中耐蚀性的影响,通过SEM、XRD等对X80管线钢的腐蚀形貌和腐蚀产物进行了分析.结果表明,随着NS4溶液中溶解氧含量的减少,X80钢的腐蚀电位升高,腐蚀电流密度降低,腐蚀产物的致密性逐渐提高,X80钢的耐蚀性增加;氧含量较高时,腐蚀产物表面高低不平,表面存在大量裂缝、孔洞等缺陷,表面致密性较差,氧含量减少后,腐蚀产物平整致密;随着溶解氧含量的不同,腐蚀后生成了不同的腐蚀产物.

环境因素对X80管线钢在NS4溶液中腐蚀性的影响

通过动电位极化方法研究了温度、溶解氧、pH值等环境因素对X80管线钢在NS4溶液中腐蚀性的影响,并将三者对X80钢腐蚀速率的影响程度进行了灰关联分析。动电位极化曲线试验结果表明:随着NS4溶液中溶解氧含量的减少,X80钢的腐蚀电流密度(icorr)降低,耐腐蚀性增加;随着溶液温度升高和溶液pH值降低,X80钢的腐蚀电流密度增加,耐腐蚀性下降;灰关联分析结果表明:根据关联度的大小,环境因素对X80钢腐蚀速率影响大小的顺序为溶解氧、溶液pH值、温度。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4A抗原模拟表位的筛选和鉴定

目的 筛选丙型肝炎病毒 (hepatitisCvirus,HCV)非结构蛋白NS4A(HCVNS4A)特异性噬菌体模拟表位 ,为抗HCV的疫苗研究探索新途径。方法 以抗 HCVNS4A的单克隆抗体作为固相筛选分子 ,对人工合成的噬菌体随机 1 2肽库进行 5轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选过程 ,随机挑取 45个克隆 ,经噬菌体酶联免疫吸附法 (ELISA)鉴定并进行交叉反应实验以及竞争抑制性结合实验 ,最后对所选克隆进行DNA序列分析 ,以确定HCVNS4A抗原的模拟表位。结果 经噬菌体富集后 ,从随机筛选的 45个克隆中得到 1 3个阳性克隆 ,确定氨基酸序列XXRXXMXPXXXI为HCVNS4A的模拟表位。结论 用噬菌体 1 2肽库成功筛选得到HCVNS4A的模拟表位 。

蓝舌病病毒新型NS4蛋白的亚细胞定位分析及功能预测

蓝舌病病毒（bluetongue virus,BTV）编码4种非结构蛋白（NS1~NS4）,其中NS4是新发现的非结构蛋白。为深入探索该新型非结构蛋白的功能,本研究首先采用生物信息学分析其序列结构特征及可能的功能域,结果发现NS4蛋白的N端α-螺旋结构域中具有富含碱性氨基酸的核定位信号（NLS）,而C端α-螺旋结构域中具有亮氨酸拉链结构的核输出信号（NES）。为进一步证实NS4的亚细胞定位,本试验构建了表达NS4全长及其缺失突变体的重组质粒,结果显示缺失NLS的NS4重组蛋白弥散在胞浆,而缺失NES后NS4重组蛋白只定位于细胞核,表明NS4蛋白亚细胞定位具有核—胞浆穿梭过程。最后结合3D同源建模发现NS4与CCAAT增强子结合蛋白（C/EBPβ）等具有较高的同源性,据此推测NS4可能为转录调控蛋白,与DNA或其他转录因子存在相互作用。总之,本研究为NS4蛋白的功能研究提供了更多新线索和新思路,填补了BTV基础研究的空白。

丙型肝炎病毒NS4区多肽的抗原性研究及应用

为挑选NS4中的优势抗原表位用于丙型肝炎病毒(HCV)的血清学检测,对相应区段的多肽进行了细致分析,以选择合适的肽段进行研究。在以Goldkey软件分析NS4肽氨基酸序列的基础上,采用人工合成肽技术合成了3条多肽,分别含15,21和28个氨基酸残基(依次命名为P15P21和P28),并研究了各肽段的抗原性。通过DNA合成和基因工程技术,表达了选择的优势抗原决定簇。将其用于HCV阳性和阴性系列血清的检测,结果表明,根据上述研究构建的融合NS4多肽抗原的抗原性优于合成肽,可用于作为HCVEIA的试剂。

丙型肝炎病毒NS4A抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定

为探索新型治疗方法 ,制备抗丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS4A的抗独特型人源单链可变区抗体 (抗 IdscFv) ,采用噬菌体表面展示技术 ,将抗HCVNS4A单克隆抗体固相包被于Nunc板 ,应用半合成的人源单链可变区抗体文库技术 ,从噬菌体单链可变区抗体库中经过 5轮“吸附 洗脱 扩增”筛选过程 ,随机挑选 82个克隆 ,利用酶联免疫吸附法 (ELISA)、交叉反应和竞争抑制实验 ,对其进行免疫学检测和鉴定 ,获得与HCVNS4A单克隆抗体结合活性较强的抗 IdscFv阳性克隆 ,并对HCVNS4A特异性抗 IdscFv的编码基因进行序列测定分析。结果 ,经过筛选 82个克隆中有 4 0株克隆ELISA的吸光度 (A4 5 0nm)值较高 ,将这些噬菌体上清与牛血清白蛋白 (BSA)进行交叉反应 ,确定其中有 7株交叉反应较弱 ,结合 2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果 ,最后确定 1株阳性克隆。提取质粒 ,进行DNA序列测定 ,DNA为 789bp。本实验结果提示 ,用噬菌体抗体库技术能够成功地获得抗HCVNS4A的抗 IdscFv,为开展用抗

丙型肝炎病毒NS4B蛋白调控Hep3B细胞非折叠蛋白质反应研究

研究表达的丙型肝炎病毒(HCV)NS4B对Hep3B细胞非折叠蛋白质反应的影响。NS4B重组真核表达质粒pcDNA3.1(-)NS4B通过脂质体转染Hep3B细胞,G418筛选和Western blot鉴定稳定转染细胞;RT-PCR检测稳定转染细胞内XBP1 mRNA剪接,Western blot鉴定ATF6蛋白切割,荧光素酶试验检测稳定转染细胞内GRP78和XBP1启动子活性。G418筛选和Western Blot鉴定证实获得稳定表达NS4B的Hep3B细胞;在该细胞内,XBP1 mRNA剪接、ATF6切割、XBP1和Grp78启动子激活均被检测到。NS4B在Hep3B的稳定表达诱导了非折叠蛋白质反应。

X90管线钢及焊缝在空气和近中性NS4溶液中的应力腐蚀开裂行为

采用慢应变速率拉伸试验研究了X90管线钢(母材)及焊缝在空气和近中性NS4溶液中的应力腐蚀开裂(SCC)行为。结果表明:试验钢母材和焊缝在近中性NS4溶液中具有一定的SCC敏感性,且焊缝的敏感性高于母材的,主要表现为塑性损失;母材及焊缝在空气中的拉伸断口表现为典型的韧窝微孔型韧性断裂,在NS4溶液中表现为混合断裂特征。

研究NS4溶液中X-42钢楔形缝隙的阴极极化行为

采用自制的模拟楔形缝隙试样研究了X 42钢在NS4溶液中非极化状态和缝口控制电位分别为-776mVSCE和-950mVSCE的阴极极化状态时,楔形缝隙内电位、电流、溶液Cl-浓度、pH值的分布。结果表明,非极化状态的缝内电位负移,从缝口向缝尖呈递降趋势。阴极极化时缝内电位负移更甚,电位分布从缝口向缝尖呈递增趋势;缝内电流分布递减;从缝口到缝尖pH值降低、氯离子浓度升高,腐蚀敏感性增强。

输血后丙型肝炎病毒NS4区抗体的动态变化及其诊断意义

利用重组NS4抗原及合成肽5－11抗原分别检测5例输血后丙型肝炎患者的系列血清136份，并与HCV总抗体及HCVRNA检测结果比较，发现抗NS4抗体的动态变化虽然有两种模式，但在多数情况下为一种模式，即抗体阳转后很少转阴，并且其动态变化基本与总抗体相似。同时发现2例病人抗NS4抗体阳转时间早于总抗体，因此，推测HCV检测试剂中增加NS4抗原可能对提高HCV诊断试剂的灵敏度有一定意义。

丙型肝炎病毒NS3-NS4基因的表达及鉴定

目的 构建丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白NS3 NS4全长基因重组质粒并诱导表达 ,鉴定NS3 NS4蛋白的抗原性。方法 应用PCR技术从pUC19/HCV中扩增目的基因 ,构建重组表达质粒 ,进行原核表达 ,用SDS PAGE、ELISA技术对表达产物的抗原性进行鉴定。结果 成功构建、表达了重组质粒pBV2 2 0 /NS3 NS4 ,用 5 0份质控标准血清对表达蛋白质进行抗原性检测 ,与第二代诊断试剂相比 ,总符合率为 96 %。结论 全长NS3 NS4蛋白是一个优势免疫原性区 ,应该是HCVEIA诊断试剂的有效成分。

DNA微点阵分析丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B对信号传导相关基因表达的影响

目的采用DNA微点阵(DNAmicroarray)技术检测致癌相关基因的表达水平,研究丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)非结构蛋白NS4B在HCV致癌中的作用。方法通过建立稳定表达NS4B的细胞系,用微点阵技术研究NS4B对细胞基因表达的影响,实时定量RT-PCR分析微点阵结果中的两个上调基因(DKK1,FYN)和两个下调基因(AKR1C1,v-fos)的表达,对细胞中AKR1C1的活性进行酶学分析。结果在2308个信号途径相关的基因中,34个基因表达上调,56个基因表达下调。在表达有明显差异的基因中,大部分原癌基因表达上调,而大部分抑癌基因的表达下调;一些基因与细胞压力有关。实时定量RT-PCR和AKR1C1的酶学分析进一步证实了DNA微点阵的结果。结论HCV-NS4B在HCV的致癌过程中起一定作用。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B反式激活基因的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交 (suppressionsubtractivehybridization ,SSH)技术构建丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 4B(NS4B)转染细胞差异表达cDNA消减文库 ,克隆HCVNS4B蛋白反式激活相关基因。方法 以HCVNS4B表达质粒pcDNA3 .1( ) NS4B转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1( )为对照 ,制备转染后的细胞裂解液 ,提取mRNA并逆转录为cDNA ,进行抑制性消减杂交分析。将富集的二次PCR产物与T A载体连接 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑取克隆聚合酶链反应 (PCR)扩增后进行测序及同源性分析。结果 文库扩增后得到 3 3个阳性克隆 ,经菌落PCR分析显示其中 2 8个克隆含有大小不等的 2 0 0～ 10 0 0bp插入片段。测序及同源性分析显示 ,12种已知基因编码蛋白 ,包括一些与细胞周期、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因 ,可能是NS4B反式激活靶基因。结论 成功构建了HCVNS4B反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,为进一步阐明HCVNS4B反式调节的靶基因在肝炎。

猪瘟病毒石门株NS4A基因的克隆、测序及分析

采用RT-PCR技术，利用一对引物，从感染猪血中成功扩增了猪瘟病毒强毒石门株NS4A基因，片段大小为757bp，与预期大小一致。克隆后经酶切鉴定，自动化测序。序列比较表明，该基因为最保守的基因之一，其中石门株序列与ALD，GPE，HCLV及Brescia株均有很高的同源性，由其推导的氨基酸的同源性高达100％。仅与Alfort株的同源性消低。对石门株序列与同属的BVDVSD－1株和NADL株序列进行了比较。