猪瘟病毒石门株NS4B基因的序列测定及分析

采用ＲＴ－ＰＣＲ技术，利用２对引物，从猪瘟病毒（ＣＳＦＶ）强毒石门株感染的猪血中成功扩增了ＮＳ４Ｂ基因，片段大小分别为７５７ｂｐ和７７４ｂｐ。克隆后经酶切鉴定，自动测序和序列分析，结果显示该基因较为保守，与其他猪瘟病毒毒株均有很高的同源性，与同属的ＢＶＤＶＳＤ－１株和ＮＡＤＬ株也有较高的同源性。

丙型肝炎病毒非结构区NS4b基因片段的克隆和表达

采用聚合酶链反应 (PCR)技术和DNA体外重组方法 ,克隆出 5 79bp的丙型肝炎病毒 (HCV)NS4b基因片段 ,插入到原核高效表达载体 pET 2 8a中 ,构建重组质粒pET/NS4b ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)菌株 ,经IPTG诱导培养后 ,获得了目的蛋白的高效表达。SDS PAGE分析显示在 30kD处有一条表达的目的蛋白区带。通过固定化金属配体亲和层析 (IMAC)纯化目的蛋白 ,ELISA检测结果表明 ,该重组蛋白具有很好的特异性和抗原性。

BVDV非结构蛋白NS4B的结构分析及其蛋白表达与鉴定

NS4B是牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的非结构蛋白,为研究BVDV在病毒侵染宿主细胞过程中的作用,对ns4b进行了结构分析、表达载体构建及蛋白表达。采用Prot-Param、TExpasy和SignalP-4.1等软件分析NS4B蛋白的氨基酸组成、疏水性和空间结构。根据Genebank上公布的BVDVns4b基因序列设计引物,利用PCR方法获得ns4b基因片段,连接到p3×Flag-CMV10表达载体上,构建重组质粒p3×Flag-CMV10-ns4b,经双酶切与测序鉴定正确后,将p3×FlagCMV10-ns4b转染到HEK-293T细胞中,利用Western blot检测NS4B蛋白的表达。结果表明BVDV NS4B蛋白分子量为38.4 kDa,不存在信号肽,有49个磷酸化位点和6个糖基化位点,是一种主要由α-螺旋和无规则卷曲结构组成的疏水性稳定蛋白。成功构建了重组质粒p3×Flag-CMV10-ns4b,并且p3×Flag-CMV10-ns4b在HEK-293T细胞中成功表达,为今后研究NS4B蛋白在BVDV感染宿主细胞及其免疫逃逸机制奠定了基础。

流行性乙型脑炎病毒NS4B蛋白的原核表达及其结构分析

为了解流行性乙型脑炎病毒NS4B蛋白的结构及功能,本研究构建了乙脑病毒P3株ns4b基因原核表达载体,在大肠杆菌BL21中诱导表达蛋白,并通过Western blot确定所表达蛋白为目的基因的产物。DNAStar软件分析其核苷酸和氨基酸序列特征,建立遗传进化树,利用生物信息学方法对其理化性质、蛋白结构等方面进行预测。结果显示,P3株ns4b基因全长765 bp,GC含量54.64%,包含21个酶切位点,与其他毒株的遗传距离为0.8,说明ns4b基因非常保守;编码255个氨基酸,预期大小为27 KDa,其中有20个强碱性氨基酸、15个强酸性氨基酸,等电点为9.24,为碱性蛋白,中性环境中带正电。生物信息分析表明NS4B蛋白无信号肽,有3个跨膜区域;无糖基化位点,磷酸化位点26个;亲水性良好;其蛋白二级结构有较多α-螺旋与无规则卷曲,中间较大的螺旋和两端的无规则卷曲构成其特殊三级结构。试验成功构建了原核表达载体pET42b-NS4B,在大肠杆菌中以包涵体的形式表达较大量蛋白,大小与预期一致。JEV-ns4b是该病毒较为关键的非结构蛋白基因,可通过原核表达系统高效表达蛋白,研究其蛋白功能,有助于进一步优化乙型脑炎疫苗。

猪瘟病毒NS4B真核表达载体的构建与表达

猪瘟病毒NS4B蛋白是猪瘟病毒编码的一个非结构蛋白,由347个氨基酸残基组成。NS4B在病毒中可能与致细胞病变有关,具体功能尚不清楚。本试验利用PCR扩增NS4B基因,利用双酶切、连接和转化等操作方法,与质粒载体p EGFP-N3构建成真核表达重组质粒,双酶切检测猪瘟病毒NS4B真核表达载体构建成功。测定重组质粒序列,并验证表达成功,为今后的功能研究奠定了基础。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B肝细胞结合蛋白基因的筛选与克隆

目的筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)相互作用蛋白的基因,明确其具体作用机制。方法应用酵母双杂交系统3,将多聚酶链反应(PCR)法扩增的HCVNS4B基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和Xα半乳糖(Xαgal)上进行双重筛选阳性菌落,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠埃希菌,接种在氨苄西林LB平板上,选择生长菌落,提取质粒酶切鉴定,测序并在GenBank中进行生物信息学分析。结果成功克隆出HCVNS4B基因并在酵母细胞中表达,与肝文库配合后选出既能在4缺(SD/TrpLeuAdeHis)培养基又能在铺有Xαgal的4缺培养基上生长,并变成蓝色的真阳性菌落5个,序列分析显示,筛选到的肝细胞蛋白编码基因参与细胞代谢、生物氧化、生长调节等多种生物学过程。结论成功克隆出HCVNS4B蛋白与肝细胞相互作用蛋白,为进一步研究NS4B蛋白的功能,阐明HCV致病的分子生物学机制提供了新线索。