文山松毛虫质型多角体病毒(DpwCPV)NS5蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

通过对文山松毛虫质型多角体病毒 (DendrolimuspunctatusWenshanensiscytoplasmicpoly hedrosisvirus,DpwCPV)的增殖、纯化 ,获得一株单一类型的质型多角体病毒。提纯的病毒粒子经SDS 热酚法抽提得到基因组dSRNA ,使用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离并回收纯化第九片段S9。S9RNA双链经高温变性 ,逆转录合成cDNA双链。根据DpwCPV与BmCPV 1的同源性设计引物 ,将S9进行PCR扩增后 ,克隆到PMD1 8 T载体上。最终获得一个 977bp的序列 ,其中包含一个 963bp的开放阅读框 (ORF)。推测DpwCPVS9基因编码一个 32 0个氨基酸的蛋白 ,分子量约为 35 5 60。

丙型肝炎病毒基因组部份NS5区蛋白基因在大肠杆菌中的表达

在大肠杆菌中表达了丙型肝炎病毒基因组ＮＳ５区Ａ段和部份Ｂ段蛋白。ＮＳ５Ａ蛋白溶于水，可经过ＧＳＴ亲和层析柱纯化；ＮＳ５Ｂ蛋白不溶于水，经ＰＢＳ－ＴｒｉｔｏｎＸ－１００洗涤，尿素溶解后，通过离子交换柱纯化。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析，ＮＳ５Ａ蛋白除在５７ｋＤ左右有条带外，还有不同程度的降解产物；ＮＳ５Ｂ蛋白主要在５８ｋＤ左右有条带出现。为查明表达蛋白抗体在病人血清中的分布，取９４份已经Ｃ３３ｃ或Ｃ２２检测过的血清，用间接ＥＬＩＳＡ法查抗体，结果在７１份Ｃ３３ｃ或Ｃ２２阳性血清中，抗ＮＳ５Ａ抗原的抗体检出率为６４．８％；抗ＮＳ５Ｂ的检出率为５７．７％；ＮＳ５Ａ和ＮＳ５Ｂ蛋白抗体的总符合率为７５．５％。暂时未发现单独抗ＮＳ５Ａ或ＮＳ５Ｂ抗体阳性的血清。

鸭黄病毒安徽分离株NS5基因部分片段的克隆和序列分析

为研究鸭黄病毒安徽分离株遗传变异情况,通过RT-PCR获得了鸭黄病毒(Duck flavivirus)安徽分离株NS5部分基因序列DFV-NS5-1,并将该序列与GenBank数据库中登录的9条NS5基因相应序列进行比对分析。同源性分析发现克隆获得的DFV-NS5-1与国内近年来分离的黄病毒属恩塔亚病毒群的鸭坦布苏病毒基因序列同源性较高,均为98%以上;而与国外鸭坦布苏病毒NS5的EU303233基因序列的同源性相对较低,为88.5%。此外,与虫媒黄病毒属的西尼罗病毒、圣路易脑炎病毒和罗西奥病毒NS5的AF481864、EU090146和AY632542基因序列的相似度最高为74.5%。进化分析表明,DFV-NS5-1与来自于国内毒株的JQ289550、JQ314465、JF895923、JF523187和JF232077亲缘关系较近,具有共同的进化祖先,而与虫媒黄病毒属的西尼罗病毒、圣路易脑炎病毒和罗西奥病毒的遗传距离则较远。

庚型肝炎病毒NS5cDNA片段的表达及其免疫原性的研究

一段长度为 880bp的庚型肝炎病毒cDNA在大肠杆菌BL2 1(DE3)菌株中得到表达。此cDNA被插入到表达质粒 pGEX 5X 1中 ,位于编码日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶 (GST)的DNA序列下游 ,并与GST处于同一阅读框。用乳糖在 37℃下诱导表达出以包涵体形式存在的GST NS5 3融合蛋白 ,并用脲溶法提取了该蛋白 ;在 2 0℃诱导时 ,表达出的蛋白大部分可溶 ,用谷胱甘肽Sepharose 4B亲和层析柱对可溶性的融合蛋白进行了纯化。免疫印迹实验证明 ,此融合蛋白能被庚型肝炎病人的血清和自制的抗GST血清特异性地识别。用PCgene软件对NS5 3氨基酸序列的亲水性和抗原决定簇进行了分析。本研究为庚型肝炎ELISA诊断试剂研制打下了基础。

流行性乙型脑炎病毒NS5蛋白的表达

目的 在大肠杆菌中表达并纯化流行性乙型脑炎病毒NS5蛋白 ,为进一步研究乙脑病毒NS5蛋白的结构与功能奠定基础。方法 根据乙脑病毒NS5蛋白的基因序列 ,设计两对PCR引物 ,采用RT -PCR法分别扩增乙脑病毒JaOH0 5 66株部分及全长NS5基因。将扩增产物分别克隆到表达载体 pQE3 0。筛选重组质粒 ,转化大肠杆菌表达重组蛋白。重组蛋白经金属柱亲和层析纯化。结果与结论 获得了含部分及全长乙脑病毒NS5基因的重组质粒 ,重组质粒经限制性酶双酶切、DNA序列分析及PCR扩增筛选证实。在大肠杆菌中表达出了带 6个组氨酸头的部分及全长的重组乙脑病毒NS5蛋白。经SDS -PAGE及Western

同型HCV不同分离株NS5区基因片段的比较分析

对同一地区两例输血后丙型肝炎进行ＰＣＲ分型，结果为Ⅱ型。分别将其ＮＳ５区基因部分片段克隆到ｐＵＣ１８和Ｍ１３ｍｐ１８中，序列分析结果表明在ＮＳ５区基因相同区段，二者的核苷酸同源性为８９．０４％，氨基酸同源性为９０．７５％。而且在分离株Ｖ中第７０～７２位发现阅读框内终止密码子ＴＧＡ。与Ⅱ型代表株ＨＣＶＢＫ序列相比，相同区段的核苷酸和氨基酸同源性分别为：９１．５％，９１．９２％和９１．９１％，９１．９１％。对比分析表明，在同一地区基因型相同的不同分离株间ＮＳ５区基因仍存在较大变异。

HCV非结构基因NS5分子生物学研究进展

丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因5(NS5)区是RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)及一种磷蛋白的编码区,与HCV的复制、致病及抗药性关系密切。就HCV NS5区有关的分子生物学研究进展进行了综述。

重组HCV NS5区蛋白抗原在丙型肝炎检测中的应用

对HCVNS5区部分基因进行了克隆表达，获得优质NS5区蛋白抗原。通过对不同人群抗-NS5检测表明，随访3年和6年的输血后丙肝（PT－HC）病例抗一NS5阳性率分别为70．5％和80．0％；随访8年和11年慢性丙肝（C－HC）病例分别为50．7％和82．4％。一般人群阳性率仅为1．7％，正常献血员中未检出阳性。结果表明研制的NS5抗原产生持久、特异性强。16例PT－HC病人抗一NS5和HCVRNA的动态随观察时间延长，阳性率呈升高趋势（P＞0．05）。说明执-NS5抗体和HCVRNA一样可反映病毒活动状态。对11份低值阳性参比血清检测表明．加入重组NSS抗原后，可进一步提高检出率。NSS区抗原的表达成功无疑为研制我国自己的第三代诊断试剂奠定了重要基础。

SEQUENCE ANALYSIS OF THE NS5 REGION OF GBVC/HGV AND DETECTION OF THE VIRUS BY REVERSE TRANSCRIPTASE PCR

ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮＡｆｔｅｒｒｅｌｉａｂｌｅａｓｓａｙｓｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｉ－ｔｉｓＣｖｉｒｕｓ（ＨＣＶ）ａｎｄＥｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｂｅｃａｍｅａｖａｉｌ－ａｂｌｅ，ｉｔｗａｓｅｖｉｄｅｎｔｔｈａｔｍｏｓｔｏ...

2020年福建省龙岩市水禽坦布苏病毒检测及其NS5基因变异分析

为了解龙岩市水禽坦布苏病毒(ATV)感染情况及其NS5基因遗传变异情况,对采自福建省龙岩市7个县(市、区)农贸市场、规模化禽场和散养户的鸭泄殖腔棉拭子2885份、鹅泄殖腔棉拭子样品320份进行ATV RT-PCR检测,并对部分阳性样品进行病毒分离鉴定及NS5基因序列测定与遗传进化分析。结果显示:ATV总阳性率为17.19%(551/3205),其中鸭、鹅样品阳性率分别为16.81%(485/2885)、20.63%(66/320),差异显著(P<0.01);按不同场所统计,散养户水禽样品ATV阳性率最高(20.68%,304/1470),农贸市场次之(15.19%,224/1475),规模化养殖场最低(8.85%,23/260),相互间差异显著(P<0.01);按被检水禽日龄统计,90~<180日龄水禽样品阳性率最高(21.29%,397/1865),180~<380日龄次之(17.62%,74/420),30日龄内最低(4.44%,4/90);春季水禽样品阳性率(22.74%,362/1592)明显高于秋节(11.72%,189/1613)。将部分ATV阳性样品经鸭胚分离培养,共分离出13株鸭源、鹅源ATV毒株。对这13株分离株NS5基因片段进行核苷酸序列分析发现,其同源性高达98.6%~100%,与国内ATV代表株核苷酸序列同源性介于96.5%~99.7%,且处于同一进化树分支,而与澳大利亚等国外分离株亲缘关系较远。结果表明,目前福建省龙岩市鸭、鹅等水禽中存在不同程度的ATV感染,流行毒株仍为国内当前流行毒株,未出现明显变异。本研究了解了该地区ATV的流行特点及基因遗传进化情况,为制定ATV感染防控措施提供了依据。

坦布苏病毒荧光定量RT-PCR方法的建立

【目的】利用SYBR GreenⅠ荧光定量技术建立一种相对定量检测坦布苏病毒的方法。【方法】针对坦布苏病毒NS5、E基因分别设计了1对特异性引物,同时设计1对扩增内参基因β-actin引物,将PCR扩增的片段分别连接到pMD18-T载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,倍比稀释作为质控样品,用于实时荧光定量PCR中NS5、E基因及内参基因β-actin标准曲线的构建,并进行反应的灵敏性、特异性和重复性试验。【结果】结果显示标准曲线线性关系R2值均在0.99以上,检测极限约为1.0E+01拷贝数质粒DNA;特异性结果表明只能检测到坦布苏病毒的扩增曲线;批内和批间重复性试验的变异系数均小于0.5%;用已建立的方法对临床样品进行3次重复检测,病毒RNA的检出率为100%。【结论】本研究初步建立了基于坦布苏病毒NS5、E基因的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR的方法,为养鸭场诊断和监测坦布苏病毒提供了一种新的特异、灵敏的检测方法。

鹅源坦布苏病毒 RT-LAMP快速检测方法的建立

坦布苏病毒是新发现的一种可引起家禽产蛋和采食量下降及死亡的黄病毒属病毒。根据GenBank中登录的鹅源坦布苏病毒NS5基因序列,利用Primer Explorer V4软件在序列保守区域设计1套特异识别NS5基因序列中6个不同区段的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)引物,并以此套引物建立一种基于LAMP技术的鹅源坦布苏病毒检测方法。结果表明,该方法灵敏度极高,是普通PCR方法的100倍,只能特异性扩增坦布苏病毒的RNA,对于其他常见禽RNA病毒均无特异性扩增。在反应体系中加入SYBR GreenⅠ染料后,通过肉眼观察有无绿色荧光可直接判定结果。该方法特异性强,灵敏度高,无需特殊仪器,简便,快速,适用于鹅源坦布苏病毒的临床快速检测。

登革病毒Ⅱ(NGC株)pET-42a-NS_(4b)-NS_5载体构建

目的:构建NS4b-NS5基因的原核表达载体。方法:用RT-PCR技术扩增DEN2(NGC株)全长的NS4b-NS5基因序列,并定向克隆入pET42a,构建原核表达载体pET42a-NS4b-NS5,转化BL21菌。阳性质粒用PCR、酶切等方法鉴定。结果:阳性质粒经PCR及双酶切获得了一个长为1.05Kb的基因片段。结论:成功构建了含有DEN2全长NS4b-NS5基因的原核表达载体pET42a-NS4b-NS5。

2019-2021年鸭坦布苏病毒广西流行毒株遗传多样性分析

【目的】研究鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)广西毒株分子遗传特征,以期了解、掌握DTMUV广西毒株流行新特点,为及时调整、制定有效防控措施提供数据支持。【方法】采集2019-2021年广西各地的鸭组织病料,采用已建立的实时荧光定量RT-PCR方法检测DTMUV,根据毒株检测年限和来源地选取部分阳性样品进行DTMUV全序列扩增及测序,并进行序列相似性、重要蛋白关键氨基酸位点、系统发育、全序列重组及遗传进化速率分析。【结果】共获得8株DTMUV全序列,基因组全长为10992 bp,为广西毒株。广西毒株之间开放阅读框(ORF)及E、NS5基因的核苷酸序列相似性分别为97.9%~99.8%、97.0%~99.9%和97.8%~99.9%,氨基酸序列相似性分别为99.1%~99.9%、99.0%~100%和99.3%~99.9%;与国内外参考毒株的核苷酸序列相似性分别为86.4%~99.3%、85.8%~99.5%和87.1%~99.2%,氨基酸序列相似性分别为96.0%~99.8%、94.8%~100%和97.5%~99.9%,且与水禽源TMUV相似性高于其他宿主源。与疫苗株FX2010相比,DTMUV广西毒株E蛋白共有11个氨基酸位点发生变异,其中第43、150、153、326、403、464及487位为广西毒株独特的氨基酸突变。ORF遗传进化分析结果显示,广西毒株均分布于2.1亚群,而源自广西的GX2011和GX2015株隶属于2.2亚群,表明DTMUV广西流行毒株进化趋势不完全一致;E、NS5基因系统发育趋势与ORF相似。重组分析结果表明,GXBH01-2019、GXZS02-2020、ziYY150901及HB2016株检测有重组信号。E、NS5基因的遗传进化速率估算分别为1.31×10^(-3)和1.30×10^(-3)替换/(位点·年),表明二者进化较为同步。【结论】当前DTMUV广西流行毒株表现为与主要流行毒株亲缘性较近,E蛋白发生特有氨基酸突变,进化趋势不一致,存在重组现象等分子特征,结果为制定有效防控措施提供了基础数据。

Discrepancy of Classical Swine Fever Virus in Different Tissues by One-Step RT-PCR and Nested RT-PCR

Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was used for the detection of classical swine fever virus (CSFV) in blood and tissue samples of field cases and experimentally inoculated pigs. The distribution of CSFV in different organ samples showed some discrepancies in infected pigs. Four weaner pigs were inoculated with C-strain vaccine virus, then samples of spleen, tonsil, lung, mesenteric lymph node, kidney and brain were collected after slaughter and tested for E2 and NS5B genes using one-step RT-PCR and nested RT-PCR. Using the same method, 12 field cases were simultaneously studied. A discrepancy of CSFV in different samples was found upon detecting the target gene. The most reliable diagnostic organs were spleen and tonsil, and the nested RT-PCR assay provided a highly sensitive and specific method with comparable performance to the one-step RT-PCR assay.

鸭坦布苏病毒荧光定量RT-PCR方法的建立及应用

为建立鸭坦布苏病毒(duck tembusuvims,DTMUV)荧光定量RT-PCR (qRT-PCR)检测方法,对DTMUV的NS5基因设计特异性引物和MGB探针,使用RT-PCR扩增NS5基因并将其连接到pEASY-T1载体上构建重组质粒,提取阳性重组质粒作为qRT-PCR阳性模板绘制标准曲线,用SYBRGreenI法检测MGB探针法qRT-PCR的引物是否有非特异性扩增,并进行特异性、敏感性、重复性试验和临床样品检测。结果显示:MGB探针法qRT-PCR标准曲线的相关系数为0.999 3,其引物没有非特异性扩增;对于其他阳性样本,如鸭肝炎病毒(DHV)、新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)等抗原无扩增曲线,只能检出DTMUV;qRT-PCR敏感性可达3×10^(2) copies/μL,是普通RT-PCR的10 000倍;批内和批间重复性试验变异系数(CV)为0.08%~0.49%,均小于0.5%。从云南省不同地区采集20份临床出现产蛋下降症状的病鸭组织,应用试验建立的qRT-PCR方法检出12份阳性样品,而普通RT-PCR检出10份,两者的阳性率分别为60% (12/20)和50% (10/20)。结果表明,本试验成功建立了基于DTMUV NS5基因的MGB探针qRT-PCR检测方法,其标准曲线线性关系显著,特异性强,与其他禽源性病原无交叉反应性,敏感性和重复性良好,敏感性和阳性检出率较普通RT-PCR高,更适合于DTMUV感染的临床诊断和流行病学调查。

鸭坦布苏病毒快速实时荧光RT-LAMP方法的建立及初步应用

为建立检测鸭坦布苏病毒(DTMUV)的荧光逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测方法,根据DTMUV NS5基因保守序列设计1套特异性引物,对反应时间和温度进行优化,并评价该方法的特异性、敏感性、重复性和临床适用性。结果显示:建立的荧光RT-LAMP最优反应条件为65℃25 min;只特异性扩增DTMUV,而不扩增其他几种禽类病毒;最低检测限为4×10^(2)copies/μL,与qRT-PCR方法敏感性一致,是普通RT-PCR的100倍;批内和批间重复性高;应用该方法检测DTMUV不同剂量人工感染鸭肝脏样品,对接毒剂量为10^(3-7)TCID_(50)和10^(2-7)TCID_(50)组的阳性检出率均为100%,对接毒量10^(1.7)TCID_(50)组的阳性检出率为90%(9/10)。结果表明,本研究建立的荧光RT-LAMP检测方法特异性强、重复性好、敏感性高,可成为快速诊断DTMUV的方法之一。

用DNA重组法表达HCV部分NS4-NS5基因

为研究丙肝病毒的复制机理,制备检测丙肝抗体的诊断试剂,需要大量纯化的各种丙肝病毒蛋白。我们在国内首次用DNA重组的办法,在大肠杆菌中表达了HCV部分NS4—NS5基因。在SDS—PAGE中,表达产物呈现一条约50kD的电泳带,表达蛋白约占菌体总蛋白的20％。该表达蛋白经分子杂交分析,可与抗-HCV非结构区抗体血浆发生特异反应。用部分提纯的表达蛋白制备的ELISA试剂,可特异地检测出我国抗—HCV诊断试剂参考品全部10个阳性样品,而对全部10个阴性样品均未发生特异反应,显示了该表达产物可用于制备抗—HCV诊断试剂的前景。

庚型肝炎病毒NS5区部分基因的表达及其在EIA中的初步应用

目的 在大肠杆菌中表达HGVNS5抗原 ,以建立HGV抗体血清学检测方法。方法 利用反转录PCR(RT PCR)法从人血浆中分离庚型肝炎病毒NS5部分基因 ,克隆到pRSETA载体 ,经酶切初步鉴定后进行DNA序列分析 ,结果表明克隆序列正确。以pPROEX 1为表达载体 ,转化DH5α ,诱导表达后进行SDS PAGE和Westernblot分析。结果 克隆的基因片段在大肠杆菌中表达出相对分子质量 (Mr)约 2 0× 10 3 的可溶性蛋白 ,其氨基端含有 6个组胺酸肽段 ,可经Ni NTA亲和层析纯化。免疫印迹分析表明 ,该表达产物可与HGV感染患者体内的HGV抗体特异性结合。结论 克隆了HGVNS5部分基因并获得初步表达 ,表达的HGVNS5蛋白具有特异抗体结合活性 。

大理地区丙型肝炎病毒NS5基因基础上的分型研究

对大理地区2014年流行的丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)的非结构蛋白5(Nonstructural protein 5,NS5)基因序列进行分析研究,以了解云南省大理地区流行的HCV基因型或基因亚型。2014年1～10月在大理州人民医院收集临床诊断丙型肝炎病人血清,共收集到血清48份;对这些标本进行病毒核酸提取和反转录合成cDNA,采用HCV NS5基因特异引物进行RT-PCR扩增,27份标本扩增阳性,序列分析结果显示:5株与基因3a型HCV位于同一进化簇中,核苷酸同源性在90.8%～98.3%之间;14株与基因3b型位于同一进化簇中,核苷酸同源性在87.5%～98.6%之间;5株与基因1b型HCV位于同一进化簇中,核苷酸同源性在91%～97.7%之间;3株与基因6n型位于同一进化簇中,核苷酸同源性在92.8%～96.5%之间,表明本次分离到的27株HCV病毒中,5株属于3a型,14株属于3b型,5株属于1b型,3株属于6n型等3个基因型4个基因亚型。以上研究提示大理地区至少存在1b、3a、3b和6n基因亚型HCV流行,但以基因3型(3a、3b)为主要流行HCV基因型或基因亚型。