鸭黄病毒安徽分离株NS5基因部分片段的克隆和序列分析

为研究鸭黄病毒安徽分离株遗传变异情况,通过RT-PCR获得了鸭黄病毒(Duck flavivirus)安徽分离株NS5部分基因序列DFV-NS5-1,并将该序列与GenBank数据库中登录的9条NS5基因相应序列进行比对分析。同源性分析发现克隆获得的DFV-NS5-1与国内近年来分离的黄病毒属恩塔亚病毒群的鸭坦布苏病毒基因序列同源性较高,均为98%以上;而与国外鸭坦布苏病毒NS5的EU303233基因序列的同源性相对较低,为88.5%。此外,与虫媒黄病毒属的西尼罗病毒、圣路易脑炎病毒和罗西奥病毒NS5的AF481864、EU090146和AY632542基因序列的相似度最高为74.5%。进化分析表明,DFV-NS5-1与来自于国内毒株的JQ289550、JQ314465、JF895923、JF523187和JF232077亲缘关系较近,具有共同的进化祖先,而与虫媒黄病毒属的西尼罗病毒、圣路易脑炎病毒和罗西奥病毒的遗传距离则较远。

丙型肝炎病毒非结构区NS5基因片段的克隆和表达

从抗 HCV和HCVRNA均为阳性的病人血清中 ,采用RT PCR技术扩增得到HCVNS5基因片段。用含此基因片段的重组质粒pET 2 8a转化大肠杆菌BL2 1(DE3)后可高效表达NS5蛋白。该蛋白可用固定化金属离子螯合层析法 (IMAC)纯化。经Westernblot和ELISA检测结果表明 ,纯化的NS5蛋白可与丙型肝炎患者血清发生特异反应 ,在HCV感染的诊断中可能具有良好的应用前景。

2020年福建省龙岩市水禽坦布苏病毒检测及其NS5基因变异分析

为了解龙岩市水禽坦布苏病毒(ATV)感染情况及其NS5基因遗传变异情况,对采自福建省龙岩市7个县(市、区)农贸市场、规模化禽场和散养户的鸭泄殖腔棉拭子2885份、鹅泄殖腔棉拭子样品320份进行ATV RT-PCR检测,并对部分阳性样品进行病毒分离鉴定及NS5基因序列测定与遗传进化分析。结果显示:ATV总阳性率为17.19%(551/3205),其中鸭、鹅样品阳性率分别为16.81%(485/2885)、20.63%(66/320),差异显著(P<0.01);按不同场所统计,散养户水禽样品ATV阳性率最高(20.68%,304/1470),农贸市场次之(15.19%,224/1475),规模化养殖场最低(8.85%,23/260),相互间差异显著(P<0.01);按被检水禽日龄统计,90~<180日龄水禽样品阳性率最高(21.29%,397/1865),180~<380日龄次之(17.62%,74/420),30日龄内最低(4.44%,4/90);春季水禽样品阳性率(22.74%,362/1592)明显高于秋节(11.72%,189/1613)。将部分ATV阳性样品经鸭胚分离培养,共分离出13株鸭源、鹅源ATV毒株。对这13株分离株NS5基因片段进行核苷酸序列分析发现,其同源性高达98.6%~100%,与国内ATV代表株核苷酸序列同源性介于96.5%~99.7%,且处于同一进化树分支,而与澳大利亚等国外分离株亲缘关系较远。结果表明,目前福建省龙岩市鸭、鹅等水禽中存在不同程度的ATV感染,流行毒株仍为国内当前流行毒株,未出现明显变异。本研究了解了该地区ATV的流行特点及基因遗传进化情况,为制定ATV感染防控措施提供了依据。

血清HCV RNA NS_5基因的检测及其意义

利用源自ＮＳ＿５和５＇－ＵＴＲ引物进行丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ基因片段的逆转录－套式多聚酶链反应（ＲＴ－ｎｅａｔｅｄＰＣＲ）检测。对３５例随机选择的抗ＨＣＶＡｂ（＋）血清的检测结果表明，两种引物检测结果的敏感性无显著性差别。利用ＮＳ＿５区引物扩增的片段可与５种不同型别的ＨＣＶＲＮＡ亚基因探针很好地结合和显色，说明ＮＳ＿５基因可以利用于ＨＣＶＲＮＡ的基因分型。对１３１例抗ＨＣＶＡｂ（＋）血清进行了ＮＳ＿５基因检测，检出率为５２．６８％（６９／１３１），其小，除ＨＣＣ和ＣＲＦ组检出率分别为１６．６７％和３４．６８％，其余各组均在５０～８０％之间。献血组、献浆组和免疫球蛋白中ＨＣＶＲＮＡ的检出率分别为６６．６１％，５４．４５％和５７．１４％，说明应用未经筛查的血液及血制品小有很高的感染危险性，２２例抗ＨＣＶＡｂ（－）ＮＡＮＢＨ患者中有８例第２次ＰＣＲ后确证为ＨＣＶＲＮＡ（＋），表明１／３与低水平的ＨＣＶ感染有关。

HCV非结构基因NS5分子生物学研究进展

丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因5(NS5)区是RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)及一种磷蛋白的编码区,与HCV的复制、致病及抗药性关系密切。就HCV NS5区有关的分子生物学研究进展进行了综述。

“双退火温度”多聚酶链反应扩增丙型肝炎病毒NS_5基因

“双退火温度”多聚酶链反应扩增丙型肝炎病毒ＮＳ_５基因李庆生，郭建平，陶其敏（北京医科大学人民医院肝病研究所，北京１０００４４）我们在扩增丙型肝炎病毒ＮＳ５基因中，探讨了退火温度与扩增产物特异性之间的关系，发现“双退火温度”多聚酶链反应可很好地解决目?..

牛病毒性腹泻病毒陕西株的分离与NS_(5b)基因序列测定

【目的】分离并鉴定陕西省牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)。【方法】采集腹泻犊牛的肠系膜淋巴结,处理后接种于MDBK细胞,盲传,逐日观察是否有细胞病变产生。采用病毒蚀斑技术对病毒克隆纯化后,提取其RNA,进行RT-PCR鉴定。将扩增的NS5b基因克隆入pMD18-T载体中,采用碱裂解法小量提取质粒,并对质粒进行EcoRⅠ和SalⅠ双酶切、SalⅠ单酶切及PCR鉴定,对阳性克隆进行核苷酸序列测定及分析。采用病毒蚀斑试验测定分离毒株的半数组织培养感染量(TCID50)。【结果】盲传4代后细胞出现典型、规律的细胞病变。RT-PCR扩增出预期长度(360 bp)的基因片段,核苷酸序列分析结果表明,所扩增的基因为牛病毒性腹泻黏膜病病毒NS5b基因,其与BVDV VEDEVAC株NS5b基因核苷酸序列有99%同源性。BVDV陕西株的半数组织培养感染量(TCID50)为3.6。【结论】成功分离了牛病毒性腹泻病毒陕西株,为陕西省BVDV的防治提供了理论依据。

基于丙型肝炎病毒NS5B基因序列分析的基因分型

目的 :建立基于丙型肝炎病毒 (HCV)NS5B基因序列分析的基因分型方法 ,对上海地区慢性丙型肝炎进行基因分型。方法 :用HCVRNA实时荧光定量检测试剂盒对慢性丙型肝炎患者血清标本的HCVRNA水平进行定量分析。用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)和套式 PCR扩增HCVRNA阳性的 4 1份标本的部分HCVNS5B区基因 ,PCR产物经回收、纯化后直接进行测序分析。从GenBank中下载 2 5份不同基因型的HCV原型序列 ,用NS5B区 2 2 2bp的基因片段构建系统进化树 ,对临床标本相应的HCVNS5B区序列进行分析。结果 :基于HCVNS5B基因序列的系统进化树分析 ,可成功地对本组 4 1份标本进行基因分型。分型结果显示 ,1b型占 85 .4 % (35 / 4 1) ,2a型占 12 .2 0 % (5 / 4 1) ,3a型占 2 .4 4 % (1/ 4 1)。结论 :基于HCVNS5B区基因序列的系统进化树分析是一种可靠和方便的HCV基因分型方法。上海地区的HCV基因型以

文山松毛虫质型多角体病毒(DpwCPV)NS5蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

通过对文山松毛虫质型多角体病毒 (DendrolimuspunctatusWenshanensiscytoplasmicpoly hedrosisvirus,DpwCPV)的增殖、纯化 ,获得一株单一类型的质型多角体病毒。提纯的病毒粒子经SDS 热酚法抽提得到基因组dSRNA ,使用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离并回收纯化第九片段S9。S9RNA双链经高温变性 ,逆转录合成cDNA双链。根据DpwCPV与BmCPV 1的同源性设计引物 ,将S9进行PCR扩增后 ,克隆到PMD1 8 T载体上。最终获得一个 977bp的序列 ,其中包含一个 963bp的开放阅读框 (ORF)。推测DpwCPVS9基因编码一个 32 0个氨基酸的蛋白 ,分子量约为 35 5 60。

丙型肝炎病毒NS5A反式激活基因1的原核表达及多克隆抗体制备

目的构建丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A的反式激活蛋白1(NS5ATP1)基因的原核表达载体并诱导其表达,纯化表达的融合蛋白并制备多克隆抗体。方法从pGBKT7-NS5ATP1质粒上切取NS5ATP1基因,克隆入pET32a(+)质粒,构建pET32a(+)-NS5ATP1表达载体,IPTG诱导融合蛋白表达。亲和镍柱层析纯化该融合蛋白后,免疫新西兰兔,获得多克隆抗体,ELISA法检测多抗效价。结果以pET32a(+)-NS5ATP1表达载体分别转化DH5α、BL21菌后,经IPTG诱导,成功获得分子量为56kD左右的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示,IPTG诱导4.5h时重组蛋白的表达量最高。Western blot证实其具有良好的抗原性。用该蛋白成功免疫新西兰白兔,获得了该蛋白的多克隆抗体,ELISA检测其效价>1∶512000。结论成功构建原核表达载体pET32a(+)-NS5ATP1,表达纯化NS5ATP1融合蛋白并制备了该蛋白的多克隆抗体,为进一步的研究奠定了基础。

丙型肝炎病毒NS5A基因真核表达载体的构建

目的:构建HCV NS5A/pCI-neo真核表达载体,转染Huh-7细胞系,为体外高效表达NS5A蛋白奠定基础。方法:用PCR方法从带有丙型肝炎病毒NS5A基因的pC DNA 3.1(+)/HCV NS345质粒中扩增出HCV NS5A基因,然后TA克隆于pGEM-T载体中,转化大肠杆菌JM109。阳性克隆经测序鉴定,再经双酶切消化后插入真核表达载体pCI-neo上,经酶切鉴定与测序证实。结果:用PCR方法扩增出HCV NS5A基因全序列,因其cDNA的G+C含量高直接测序未成功,后经TA克隆,筛选得到的阳性克隆经测序鉴定,与设计的HCV NS5A基因序列完全一致。经酶切连接并成功插入pCI-neo上。结论:成功构建了高效表达丙型肝炎病毒NS5A基因的pCI-neo真核表达载体。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP1的反式调节基因筛选

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP1反式激活的相关基因,从分子生物学的角度研究HCV致病机制。方法:以NS5ATP1表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照组,从中分别提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR)扩增,将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR扩增后进行测序及生物信息学分析。结果:成功构建NS5ATP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后将阳性克隆经菌落PCR分析,得到90个200～1000bp的插入片断。挑选含插入片段的30个克隆进行测序,通过生物信息学分析得到3种已知序列的基因(Ras癌基因家族成员RAN、DNA依赖的RNA聚合酶Ⅱ多肽C、核糖体蛋白L2)和1个未知功能的序列(推测为新基因)。结论:筛选得到的cDNA基因全长序列包括一些与细胞基因表达及恶性转化相关的蛋白质编码基因,为HCVNS5A可能存在的调控机制提供新的线索。

抑制丙型肝炎病毒NS5A基因表达的shRNA系统的构建及意义

目的:构建抑制丙型肝炎病毒NS5A基因(HCV NS5A)表达的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体系统,观察其对HCV NS5A蛋白表达的抑制作用。方法:根据HCV NS5A基因已知序列,设计3段19个碱基的HCV NS5A特异性靶序列,合成两对63 bp并含有编码shRNA序列的寡核苷酸,双链退火后,克隆到经过BamHⅠ和HindⅢ双酶切后线性的pSilencerTM3.1-H1neo载体的H1启动子下游,重组构建RNA干扰(RNAi)质粒,进行电泳,将3个不同的RNAi质粒和阴性对照质粒分别与HCV NS5A真核表达质粒共转染正常肝细胞HL-7702细胞系,用Western blotting印迹法鉴定NS5A蛋白表达。结果:对重新构建的pSilencerTM3.1-H1neoHCV NS5A-R1、R2、R3质粒进行测序,与设计的序列完全相同;3个质粒电泳均在4 348 bp处出现特异性条带;Western blotting印迹法测得R1、R2和R3的NS5A蛋白未见明显条带,阴性对照质粒NS5A蛋白在相对分子质量5 600处出现条带。结论:设计合成的3个不同位点的63个碱基均成功插入到预计位点,并且序列完全正确,对HCV NS5A基因表达有特异性抑制作用。

小鼠和大鼠NS5ATP4同源基因序列的生物信息学分析

目的:克隆、鉴定、分析小鼠和大鼠NS5ATP4基因序列, 确定编码产物序列,并对于其与人的NSSATP4基因及其编码产物的序列的同源性进行分析. 方法:利用基因芯片技术获得了人NS5ATP4的cDNA序列,利用生物信息学技术确定小鼠、大鼠的NS5ATP4的基因及其编码产物的序列,并对于其同源性进行生物信息学分析. 结果:利用生物信息学技术确定了小鼠和大鼠的NS5ATP4 的基因及其编码产物的序列,小鼠和大鼠的NS5ATP4编码基因区分别由762和756个核苷酸(nt)组成.编码产物分别由263和261个氨基酸残基(aa)组成.与人NS5ATP4基因和蛋白质一级结构序列的同源性分别为90.29%,84.25%和95.65%,86.96%. 结论:应用生物信息学技术确定了小鼠和大鼠的NS5ATP4 的基因及编码产物的序列.

湖北地区丙型肝炎患者HCV基因分型及HCV NS5B耐药突变位点分析

目的:检测湖北地区丙型肝炎(丙肝)患者丙肝病毒(HCV)基因分型及HCV NS5B基因耐药突变位点的分布特征。方法:收集自2011-03-2014-05在本院确诊的来自湖北地区的丙肝患者外周静脉血标本273例,采用一代测序法检测每例样本的HCV和NS5B基因序列,将测得的序列与Blast进行在线比对后,统计分析HCV基因型和各亚型检出率,以及HCV NS5B耐药突变位点在HCV各基因亚型中的分布差异。结果:273例丙肝患者共检出1、2、3、6四种基因型和1a、1b、2a、3a、3b、6a六种基因亚型,其中1b亚型检出率较高,占76.19%(208/273),其次是2a亚型,占15.02%(41/273),其它各亚型检出率均不超过4.40%,各亚型检出率差异有统计学意义(P<0.05)。HCV NS5B基因以L159F突变率较高,占17.95%(42/234),与其它位点的基因突变率差异有统计学意义(P<0.05)。同时各个位点的耐药突变发生在2a亚型中的比例较高,达57.26%(134/234),显著高于其它亚型的耐药突变(P<0.05)。结论:分析湖北地区丙肝患者HCV基因分型及HCV NS5B耐药突变位点的分布特点,可为该地区丙肝患者的个体化治疗提供指导依据。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因1的克隆

目的:应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术(bioinformatics)筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A反式激活新型靶基因,进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制. 方法:以HCV NS5A蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5A 转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析.应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,分析并克隆HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因. 结果:对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,从转染pcDNA3.1(-)-NS5A的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,命名为NS5ATP1. NS5ATP1基因的编码序列全长为1011个核苷酸(nt),编码产物由336个氨基酸残基(aa)组成. 结论:HCV NS5ATP1是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白,而SSH是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术.通过这种技术,发现了HCV NS5ATP1反式激活作用的新的靶基因,这一发现,为进一步研究HCV NS5ATP1蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础.

以AdMax载体系统构建携带HCV NS5B基因的重组腺病毒表达载体

目的构建表达丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因NS5B的重组腺病毒表达载体,并对其相关指标进行鉴定,为进一步研究防止丙型肝炎感染的基因免疫和基因治疗奠定实验基础。方法应用基因工程技术将HCVNS5B基因定向克隆至穿梭质粒pDC316上,利用脂质体介导的方法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHGloxΔE1、3Cre和穿梭质粒pDC316-NS5B共转染293细胞,进行同源重组,产生重组腺病毒pAd-NS5B并进行鉴定、反复感染293细胞进行扩增,扩增后测定重组病毒滴度。结果重组病毒颗粒pAd-NS5B经双引物PCR、凝胶电泳证明插入片段与HCV非结构基因NS5B片段大小相符;经测序证明其插入序列与设计HCV NS5B基因序列完全一致,扩增后重组病毒滴度达到2.3×1013IU/L。结论成功构建了表达HCV NS5B基因的重组腺病毒载体。

大理地区丙型肝炎病毒NS5基因基础上的分型研究

对大理地区2014年流行的丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)的非结构蛋白5(Nonstructural protein 5,NS5)基因序列进行分析研究,以了解云南省大理地区流行的HCV基因型或基因亚型。2014年1～10月在大理州人民医院收集临床诊断丙型肝炎病人血清,共收集到血清48份;对这些标本进行病毒核酸提取和反转录合成cDNA,采用HCV NS5基因特异引物进行RT-PCR扩增,27份标本扩增阳性,序列分析结果显示:5株与基因3a型HCV位于同一进化簇中,核苷酸同源性在90.8%～98.3%之间;14株与基因3b型位于同一进化簇中,核苷酸同源性在87.5%～98.6%之间;5株与基因1b型HCV位于同一进化簇中,核苷酸同源性在91%～97.7%之间;3株与基因6n型位于同一进化簇中,核苷酸同源性在92.8%～96.5%之间,表明本次分离到的27株HCV病毒中,5株属于3a型,14株属于3b型,5株属于1b型,3株属于6n型等3个基因型4个基因亚型。以上研究提示大理地区至少存在1b、3a、3b和6n基因亚型HCV流行,但以基因3型(3a、3b)为主要流行HCV基因型或基因亚型。

丙型肝炎NS5A基因多克隆抗体的制备

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)NS5A蛋白原核表达载体,获得高产量的纯化目的蛋白,并制备其多克隆抗体。方法:应用聚合酶链反应技术,PCR扩增获得NS5A基因,将NS5A基因插入至原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠埃希菌DH5α提取质粒,验证正确后,转化大肠埃希菌BL21中,以IPTG诱导,获得NS5A融合蛋白的可诱导性表达,通过SDS-PAGE电泳、Western blot免疫印迹分析证实融合蛋白表达的特异性。利用Ni+亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。纯化蛋白免疫新西兰兔,利用Western blot和ELISA法对多克隆抗体进行特异性和效价检测。结果:NS5A融合蛋白表达成功,成功获得了融合蛋白及兔抗NS5A多克隆抗体。结论:成功表达NS5A基因融合蛋白,获得高特异性、兔抗NS5A多克隆抗体,为研究NS5A基因的生物学功能提供了重要制剂。