NS5ATP9与HBx相互作用促进HBV cccDNA的形成与转录

目的探讨丙型肝炎病毒NS5A反式调节蛋白9(hepatitis C virus NS5Atransactivated protein 9,NS5ATP9)在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)形成与转录中的作用机制。方法利用1.3拷贝HBV表达质粒转染Huh7和HepG2细胞、整合有4拷贝HBV基因组的HepG2.2.15细胞、在诱导型四环素启动子控制下表达HBV的HepAD38细胞构建NS5ATP9过表达或干扰的HBV细胞模型,收集样品和细胞上清液,提取RNA、HBV核心DNA(coreDNA)、cccDNA和蛋白,利用酶联免疫吸附试验、实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)、Southern blot和Western blot技术检测HBV总RNA、前基因组RNA(pregenomic RNA,pgRNA)、乙型肝炎病毒s抗原(hepatitis B virus s antigene,HBsAg)、乙型肝炎病毒e抗原(hepatitis B virus e antigene,HBeAg)、松弛环状DNA(relax circular DNA,rcDNA)以及cccDNA水平。在HepG2细胞中转染乙型肝炎病毒x蛋白(hepatitis B virus x protein,HBx),通过免疫荧光成像及免疫共沉淀方法检测NS5ATP9与HBx的结合情况。双荧光素酶报告基因实验检测NS5ATP9对HBx启动子活性的影响。利用Huh7细胞转染HBV1.3及HBV稳定表达细胞株HepG2.2.15和HepAD38转染NS5ATP9过表达/干扰质粒,通过Western blot技术检测DDB1和SMC6的蛋白水平。结果在HBV病毒活跃的细胞中,NS5ATP9 mRNA水平[HepG2.2.15细胞:1.891±0.567比1.00±0.034,t=2.87,P=0.0351;HepAD38 tet+细胞:1.978±0.399比1.00±0.034,t=4.131,P=0.0091;HepAD38 tet-细胞:2.642±0.672比1.00±0.034,t=4.127,P=0.0091]和蛋白水平均显著增加。过表达NS5ATP9后可显著增加HBeAg[(5.402±0.327)S/COV比(2.68±0.552)S/COV,t=7.35,P=0.0018]、HBsAg[(2.846±0.185)S/COV比(1.512±0.221)S/COV,t=8.02,P=0.0013]、HBV pgRNA及rcDNA的表达水平,而干扰NS5ATP9后此增加作用消失[HBeAg:(2.029±0.09)S/COV比(3.733±0.445)S/COV,t=6.501,P=0.0029;HBsAg:(1.501±0.105)S/COV比(1.878±0.174)S/COV,t=3.216,P=0.0324)]。机制研究显示,NS5ATP9和HBx蛋白主要位于细胞核核仁内,并具有共定位信号,且NS5ATP9可显著提高HBx启动子(1071.06±79.44比488.47±40.12,t=13.09,P=0.00012)的转录活性。另外,过表达NS5ATP9可显著降低DDB1和SMC6的蛋白水平,而沉默NS5ATP9则可显著提高DDB1和SMC6的蛋白水平。结论HBV上调NS5ATP9的表达,形成HBV-NS5ATP9-HBV cccDNA-HBV的正反馈环路,NS5ATP9通过与HBx相互作用上调肝细胞中HBV cccDNA的形成与转录,进而促进慢性乙型肝炎的发生发展。

牛病毒性腹泻病毒NS5A蛋白纳米抗体的筛选与鉴定

为防控牛病毒性腹泻的流行,淘选得到抗BVDV-NS5A的纳米抗体序列,并探究其结合活性。通过重组质粒pET30a-NS5A诱导表达并纯化蛋白,免疫羊驼,获得重组质粒pCANTAB 5E-VHH,构建了一个初始的抗BVDV-NS5A纳米抗体展示文库。利用3轮固相亲和筛选,对筛选后的单克隆抗体通过ELISA验证其特异性与结合力并测序、分析。构建出具有较好多样性的噬菌体展示文库,测得库容为5.3×10^(7) CFU/mL,插入率73.9%。通过评价和分析显示,得到20株不同氨基酸序列的纳米抗体,其中7株与NS5A蛋白具有较好反应性。针对抗BVDV-NS5A蛋白淘选纳米抗体,并证明得到的纳米抗体有较好的结合力。研究结果有望用于研发BVDV诊断试剂盒、抗BVDV的候选药物,同时也为后续BVDV的致病机制研究奠定了基础。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP9的克隆化研究

目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 5A(NS5A)反式激活新型靶基因 ,研究HCVNS5A反式激活作用的分子生物学机制。方法 应用抑制性消减杂交技术 (SSH)及生物信息学技术 ,以HCVNS5A表达质粒pcDNA3 1(-) -NS5A转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1(-)为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段 ,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性 ,利用表达序列标签 (EST)序列数据库的搜索和比对 ,进行电子拼接 ,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列 ,确定新型基因序列。从HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录多聚酶链反应 (RT -PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序证实 ,命名为NS5ATP9,在GenBank中注册 ,注册号为AF5 2 93 70。结果 NS5ATP9基因的编码序列全长为 3 3 6个核苷酸 (nt) ,编码产物由 111个氨基酸残基 (aa)组成 ,并成功的克隆化。结论 HCVNS5A反式激活新型靶基因NS5ATP9的筛选与克隆 。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP5的克隆

目的:应用抑制性消减杂交技术及生物信息学技术筛选并克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白5A(HCV NS5A)反式激活新型靶基因.方法:以 HCV NS5A 表达质粒 pcDNA3.1(-)-NS5A 转染HepG2细胞,以空载体 pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA 并进行抑制性消减杂交(SSH)分析.对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,与 GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性,利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,进行电子拼接,根据基因起始密码子的 Kozak 规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列.从 HepG2细胞提取总 RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实.结果:NS5ATP5基因的编码序列全长为1191个核苷酸(nt),编码产物由396个氨基酸残基(aa)组成.命名为NS5ATP5,在 GenBank 中注册,注册号为 AF529366.结论:HCV NS5A 反式激活新型靶基因 NS5ATP5的筛选与克隆,为进一步研究 HCV NS5A 反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础.

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP7的克隆

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学技术筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活新型靶基因. 方法:以HCV NS5A表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5A转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行SSH分析.对于所获基因片段序列分析表明, 其中之一为新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源陛,利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,进行电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列.从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,命名为NS5ATP7,在GenBank中注册,注册号为AF529368. 结果:NS5ATP5基因的编码序列全长为894个核苷酸(nt), 编码产物由297个氨基酸残基(aa)组成. 结论:HCV NS5A反式激活新型靶基因NS5ATP5的筛选与克隆,为进一步研究HCV NS5A反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础.

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因的克隆化研究

应用抑制性消减杂交技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白 5A(HCVNS5A)反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,克隆HCVNS5A蛋白反式激活相关基因。以HCVNS5A表达质粒pcDNA3 1(- ) NS5A转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1(- )为对照 ,制备转染后的细胞裂解液 ,提取mRNA并逆转录为cDNA ,经RsaI酶切后 ,将实验组cDNA分成两组 ,分别与两种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR ,将产物与T/A载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。文库扩增后得到 12 1个阳性克隆 ,经菌落PCR分析 ,得到 115个 2 0 0～10 0 0bp的插入片段 ,对其中的 90个片段测序 ,并进行同源性分析 ,显示 31种已知基因编码蛋白和 15种未知功能基因序列 ,包括一些与细胞周期、细胞凋亡、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因 ,可能是NS5A反式激活靶基因。结果提示 ,成功构建了HCVNS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,该文库的建立为进一步阐明HCVNS5A反式调节的靶基因及致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论依据。

筛选与克隆丙型肝炎病毒NS5A蛋白结合蛋白的基因

细胞内蛋白 蛋白的结合是丙型肝炎病毒 (HCV)与宿主肝细胞相互作用的分子生物学基础。HCV的非结构蛋白 5A(NS5A)被认为是一种HCV基因组编码的重要调节蛋白因子 ,参与HCV的复制、转录和信号传导等过程 ,但是它在HCV的致病及耐药等方面的作用还存有争议。为了进一步阐明这个多功能蛋白质与宿主蛋白的关系 ,作者采用酵母双杂交系统 3,在酵母细胞融合蛋白表达型人肝cDNA文库中进行筛选 ,得到 35个与NS5A特异性结合的阳性克隆 ,包括载脂蛋白、线粒体单体型基因、磷脂酸酸性磷酸酶等 11种已知功能蛋白质基因和 3个未知功能基因。

应用噬菌体表面展示技术筛选丙型肝炎病毒NS5A抗原模拟表位

目的:筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A(HCVNS5A)特异性噬菌体模拟表位,为抗HCV的疫苗研究探索新途径.方法:应用噬菌体表面展示技术,以抗-HCVNS5A的单克隆抗体作为固相筛选分子,对人工合成的噬菌体随机12肽库进行5轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程,随机挑取30个克隆,经噬菌体酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定并进行交叉反应实验以及竞争抑制性结合实验,最后对所选克隆进行DNA序列分析,以确定HCVNS5A抗原的模拟表位.结果:经噬菌体富集后,从随机筛选的30个克隆中得到12个阳性克隆,确定氨基酸序列XXXPXXXLLRXX为HCVNS5A的模拟表位.结论:用噬菌体12肽库成功筛选得到HCVNS5A的模拟表位,为开展用HCV模拟表位探索HCV的防治研究创造了条件.

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因2基因组DNA结构分析及其不同剪切体的克隆化研究

目的:HCV NS5A病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因NS5ATP2及其不同剪接体基因序列的确立、克隆化研究. 方法:依据我室构建的NS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,利用生物信息学技术获得,提取HepG2 细胞的总RNA,进行反转录(RT-PCR),扩增产物与原核表达载体连接,进行测序鉴定. 结果:经测序鉴定成功获得新基因的编码序列,并意外发现了NS5ATP2的不同剪接体,对NS5ATP2基因组进行分析,获得剪接体的编码序列,并成功进行了克降化研究. 结论:利用分子生物信息学技术,发现并鉴定了HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因NS5ATP2(615)及其可变剪接体NS5ATP2(216),为研究新基因的生物学功能及丙肝发病机制提供新的依据.

应用酵母双杂交技术筛选白细胞cDNA文库与NS5ATP1结合蛋白基因

目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与NSA5TP1结合蛋白的编码基因. 方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增NS5ATP1基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提出质粒并测序,进行生物信息学分析. 结果:成功克隆出NS5ATP1基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/Trp-Leu-Ade-His)培养基及铺有X- α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落10个,其中2个人HLA-B27;2个人亚砷酸盐转移子(arsA);1个人单倍型E22i线粒体;1个人pyrin (MEFV);1个人肌动蛋白素1(cofilin 1);1个人染色体15; 1个来自RP11-353N14克隆人的DNA基因,位于染色体17;1个新基因. 结论:成功克隆出NS5ATP1的结合蛋白,为进一步研究HCV的作用提供了新线索.

TAF和TDF上调NS5ATP9,汇集调控TGFβ1/Smad3、NF-κB/NLRP3炎性小体信号通路,抑制肝纤维化

【据《Hepatol Int》2020年1月报道】题:TAF和TDF上调NS5ATP9,汇集调控TGFβ1/Smad3、NF-κB/NLRP3炎性小体信号通路,抑制肝纤维化(作者ZHAO J等)来自北京地坛医院的zhao等进行了一项研究,旨在探讨替诺福韦阿芬太尼富马酸替诺福韦(TAF)/替诺福韦富马酸二异丙酚(TDF)在治疗肝纤维化中的作用和机制。首先研究了TAF/TDF对四氯化碳诱导的C57BL/6野生型或HCV非结构蛋白5A反式激活蛋白9(NS5ATP9)基因敲除小鼠肝纤维化及肝脏炎症的治疗作用。其次,体外实验检测了TAF/TDF对肝星状细胞分化、激活、增殖的影响。

丙型肝炎病毒NS5A反式激活蛋白7的重组表达及生物信息学分析

目的构建丙型肝炎病毒NS5A反式激活蛋白7(NS5ATP7)的原核表达载体,诱导其在大肠埃希菌中的表达,并初步探讨其结构与功能。方法应用逆转录PCR(RT-PCR)技术,以HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得NS5ATP7基因片段,连接到pGEM-T载体,酶切鉴定及测序正确后插入至原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导以获得NS5ATP7融合蛋白的表达,SDS-PAGE、Western blot免疫印迹分析和证实该融合蛋白表达的特异性,并应用生物信息学方法对该融合蛋白的结构和功能进行预测。结果利用RT-PCR扩增获得大小为891bp的NS5ATP7基因片段,插入pET-32a(+)表达载体,转化BL21宿主菌,经IPTG诱导,成功获得了大小为48kD的目的蛋白,Western blot进一步证实了该蛋白具有特异性免疫反应识别。生物信息学预测结果显示此蛋白富含螺旋结构,为非跨膜蛋白,无信号肽。结论利用大肠埃希菌BL21成功表达了NS5ATP7融合蛋白,结合生物信息学分析结果,为研究NS5ATP7蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了基础。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP3的克隆化研究

目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 5A(NS5A)反式激活新型靶基因。方法 以HCVNS5A表达质粒pcD NA3.1( ) NS5A转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3.1( )为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析 ,应用生物信息学方法对所获基因片段序列进行分析发现 ,其中有新型基因片段 ,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索、比对和电子拼接 ,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列 ,确定新型基因序列。从转染了pcD NA3.1( ) NS5A的HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)技术扩增 ,获得阳性克隆之后 ,进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果 该新基因的编码序列全长为 15 72nt,编码产物由 5 2 4aa组成 ,并测序证实 ,命名为NS5ATP3,在GenBank中注册 ,注册号为AF5 2 936 4。结论 分子生物学技术与生物信息学技术相结合 ,发现并鉴定、克隆了HCVNS5A反式激活作用的新型靶基因NS5ATP3。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活SV40病毒早期启动子的研究

目的 :探讨丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白NS5A的反式激活作用。方法 :扩增HCVNS5A基因 ,构建HCVNS5A基因真核表达载体 pcDNA3 1( ) NS5A ;并转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞 ,免疫印迹方法检测转染细胞中HCVNS5A蛋白的瞬时表达 ;与报告质粒 pCAT3- promoter共转染HepG2细胞 ,用酶联免疫吸附方法检测细胞中氯霉素乙酰转移酶 (CAT)的表达活性。结果 :质粒pcDNA3 1( ) NS5A在HepG2细胞瞬时表达HCVNS5A蛋白 ,共转染实验中 pcDNA3 1( ) NS5A组的CAT表达活性是空质粒对照组的 3 8倍。结论 :构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白 ,并能够反式激活SV4 0病毒早期启动子。本研究为进一步克隆HCVNS5A蛋白反式激活的靶基因 。

小鼠和大鼠NS5ATP4同源基因序列的生物信息学分析

目的:克隆、鉴定、分析小鼠和大鼠NS5ATP4基因序列, 确定编码产物序列,并对于其与人的NSSATP4基因及其编码产物的序列的同源性进行分析. 方法:利用基因芯片技术获得了人NS5ATP4的cDNA序列,利用生物信息学技术确定小鼠、大鼠的NS5ATP4的基因及其编码产物的序列,并对于其同源性进行生物信息学分析. 结果:利用生物信息学技术确定了小鼠和大鼠的NS5ATP4 的基因及其编码产物的序列,小鼠和大鼠的NS5ATP4编码基因区分别由762和756个核苷酸(nt)组成.编码产物分别由263和261个氨基酸残基(aa)组成.与人NS5ATP4基因和蛋白质一级结构序列的同源性分别为90.29%,84.25%和95.65%,86.96%. 结论:应用生物信息学技术确定了小鼠和大鼠的NS5ATP4 的基因及编码产物的序列.

基因表达谱芯片技术筛选NS5A-TP4蛋白反式调节基因

目的:对新基因NS5A-TP4转染肝癌细胞的基因表达谱进行分析,探索该基因表达对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能.方法:应用生物信息学(bioinformatics)技术,分析我室通过抑制性消减杂交技术筛选得到的新基因NS5A-TP4的全长编码序列,并NS5A-TP4构建基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A-YP4.应用基因表达谱芯片技术对重组表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5A-TP4转染的HepG2细胞和空载体处理的相同细胞差异表达的mRNA进行检测.结果:确定基因NS5A-TP4由762nt组成,编码253aa的蛋白.基因表达谱芯片所检测的1152条目的基因均为GenBank中登录的基因,NS5A-TP4表达质粒转染的细胞有18条差异表达基因,其中12条基因表达增强,6条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞信号转导、凋亡、生长调节密切相关.结论:基因表达谱芯片技术可为初步探索新基因的功能提供重要的资料.本实验结果为进一步阐明NS5A-TP4生物学功能及HCV-NS5A的致病机制提供了理论依据.

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因1的克隆

目的:应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术(bioinformatics)筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A反式激活新型靶基因,进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制. 方法:以HCV NS5A蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5A 转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析.应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,分析并克隆HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因. 结果:对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,从转染pcDNA3.1(-)-NS5A的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,命名为NS5ATP1. NS5ATP1基因的编码序列全长为1011个核苷酸(nt),编码产物由336个氨基酸残基(aa)组成. 结论:HCV NS5ATP1是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白,而SSH是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术.通过这种技术,发现了HCV NS5ATP1反式激活作用的新的靶基因,这一发现,为进一步研究HCV NS5ATP1蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础.

丙型肝炎病毒NS5A蛋白反式调节基因2不同剪切体调节靶基因的比较

目的:利用基因表达谱芯片技术筛选、比较丙型肝炎病毒NS5A反式调节基因2不同剪切体对HepG2细胞基因表达的调控作用及差异性.方法:利用分子生物学技术和生物信息学技术相结合,克隆人NS5ATP2的不同剪切体蛋白的编码基因,常规分子生物学技术构建相应的真核细胞表达载体pcDNA3.1-NS5ATP2(615)和pcDNA3.1-NS5ATP2(216).脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2利用基因表达谱芯片技术筛选转染细胞的差异表达cDNA的类型.结果:对于2个基因剪切体转染细胞系差异表达基因谱的分析,NS5ATP2(615)和NSSATP2(216)共同上调的基因43条;NS5ATP2(615)和NSSATP2(216)共同下调的基因13条;NS5ATP2(615)上调,而NS5ATP2(216)下调的基因类型3条;未发现NS5ATP2(615)下调;NS5ATP2(216)上调的基因类型;还有一些靶基因,或只受到NS5ATP2(615)的调节,或只受到NS5ATP2(216)的调节.结论:不同剪切体的作用之间有共同的靶基因,也有不同的靶基因,甚至对于同一基因有相反的调节功能.

应用表达谱芯片技术研究NS5ATP13的反式调节基因

目的:应用基因表达谱芯片研究HCV非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP13的反式调节基因. 方法:构建NS5ATP13基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)- NS5ATP13,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)- NS5ATP13转染的人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞和转染空载体的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析. 结果:HepG2细胞经转染NS5ATP13后,有86条差异基因表达,其中46条基因表达增强,40条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞的增生、分化及细胞的信号转导、代谢、凋亡密切相关. 结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了NS5ATP13的反式调节基因,为进一步阐明NS5ATP13的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.

丙型肝炎病毒NS5A反式激活基因1的原核表达及多克隆抗体制备

目的构建丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A的反式激活蛋白1(NS5ATP1)基因的原核表达载体并诱导其表达,纯化表达的融合蛋白并制备多克隆抗体。方法从pGBKT7-NS5ATP1质粒上切取NS5ATP1基因,克隆入pET32a(+)质粒,构建pET32a(+)-NS5ATP1表达载体,IPTG诱导融合蛋白表达。亲和镍柱层析纯化该融合蛋白后,免疫新西兰兔,获得多克隆抗体,ELISA法检测多抗效价。结果以pET32a(+)-NS5ATP1表达载体分别转化DH5α、BL21菌后,经IPTG诱导,成功获得分子量为56kD左右的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示,IPTG诱导4.5h时重组蛋白的表达量最高。Western blot证实其具有良好的抗原性。用该蛋白成功免疫新西兰白兔,获得了该蛋白的多克隆抗体,ELISA检测其效价>1∶512000。结论成功构建原核表达载体pET32a(+)-NS5ATP1,表达纯化NS5ATP1融合蛋白并制备了该蛋白的多克隆抗体,为进一步的研究奠定了基础。