丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活SV40病毒早期启动子的研究

目的 :探讨丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白NS5A的反式激活作用。方法 :扩增HCVNS5A基因 ,构建HCVNS5A基因真核表达载体 pcDNA3 1( ) NS5A ;并转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞 ,免疫印迹方法检测转染细胞中HCVNS5A蛋白的瞬时表达 ;与报告质粒 pCAT3- promoter共转染HepG2细胞 ,用酶联免疫吸附方法检测细胞中氯霉素乙酰转移酶 (CAT)的表达活性。结果 :质粒pcDNA3 1( ) NS5A在HepG2细胞瞬时表达HCVNS5A蛋白 ,共转染实验中 pcDNA3 1( ) NS5A组的CAT表达活性是空质粒对照组的 3 8倍。结论 :构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白 ,并能够反式激活SV4 0病毒早期启动子。本研究为进一步克隆HCVNS5A蛋白反式激活的靶基因 。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活SV40病毒早期启动子的研究

聚合酶链反应(PCR)扩增丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白NS3基因 ,克隆至真核表达载体pcDNA3 1(- )中 ,构建HCV NS3基因真核表达载体 pcDNA3 1(- ) NS3;以该质粒转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞 ,免疫印迹方法 (Westernblotting)检测转染细胞中HCVNS3蛋白的瞬时表达 ;与报告质粒pCAT3 promoter共转染HepG2细胞 ,用酶联免疫吸附方法 (ELISA)检测细胞中氯霉素乙酰转移酶 (CAT)的表达活性。结果显示 ,质粒pcDNA3 1(- ) NS3在HepG2细胞瞬时表达HCVNS3蛋白 ,共转染实验中pcDNA3 1(- ) NS3组的CAT表达活性是空质粒对照组的 4 6倍。表明构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白 ,并能够反式激活SV4 0病毒早期启动子。本研究为进一步克隆HCVNS3蛋白反式激活的靶基因 。

乙型肝炎病毒X蛋白反式激活SV40病毒早期启动子的研究

聚合酶链反应 (PCR)扩增HBVX基因 ,克隆至真核表达载体 pVR10 12中 ,构建HBVX基因重组表达载体 pVR10 12 X ;以该质粒转染HepG2细胞 ,酶联免疫吸附法 (ELISA)检测细胞X蛋白的瞬时表达 ;与报告质粒pSV lacZ共转染HepG2细胞 ,用试剂盒法检测 β 半乳糖苷酶表达活性。结果质粒 pVR10 12 X在HepG2细胞瞬时表达X蛋白 ,共转染实验中 pVR10 12 X组 β 半乳糖苷酶的表达是空质粒对照的 3 2倍。表明构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达 。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因的克隆化研究

应用抑制性消减杂交技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白 5A(HCVNS5A)反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,克隆HCVNS5A蛋白反式激活相关基因。以HCVNS5A表达质粒pcDNA3 1(- ) NS5A转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1(- )为对照 ,制备转染后的细胞裂解液 ,提取mRNA并逆转录为cDNA ,经RsaI酶切后 ,将实验组cDNA分成两组 ,分别与两种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR ,将产物与T/A载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。文库扩增后得到 12 1个阳性克隆 ,经菌落PCR分析 ,得到 115个 2 0 0～10 0 0bp的插入片段 ,对其中的 90个片段测序 ,并进行同源性分析 ,显示 31种已知基因编码蛋白和 15种未知功能基因序列 ,包括一些与细胞周期、细胞凋亡、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因 ,可能是NS5A反式激活靶基因。结果提示 ,成功构建了HCVNS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,该文库的建立为进一步阐明HCVNS5A反式调节的靶基因及致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论依据。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP9的克隆化研究

目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 5A(NS5A)反式激活新型靶基因 ,研究HCVNS5A反式激活作用的分子生物学机制。方法 应用抑制性消减杂交技术 (SSH)及生物信息学技术 ,以HCVNS5A表达质粒pcDNA3 1(-) -NS5A转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1(-)为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段 ,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性 ,利用表达序列标签 (EST)序列数据库的搜索和比对 ,进行电子拼接 ,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列 ,确定新型基因序列。从HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录多聚酶链反应 (RT -PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序证实 ,命名为NS5ATP9,在GenBank中注册 ,注册号为AF5 2 93 70。结果 NS5ATP9基因的编码序列全长为 3 3 6个核苷酸 (nt) ,编码产物由 111个氨基酸残基 (aa)组成 ,并成功的克隆化。结论 HCVNS5A反式激活新型靶基因NS5ATP9的筛选与克隆 。

丙型肝炎病毒NS5A反式激活蛋白7的重组表达及生物信息学分析

目的构建丙型肝炎病毒NS5A反式激活蛋白7(NS5ATP7)的原核表达载体,诱导其在大肠埃希菌中的表达,并初步探讨其结构与功能。方法应用逆转录PCR(RT-PCR)技术,以HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得NS5ATP7基因片段,连接到pGEM-T载体,酶切鉴定及测序正确后插入至原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导以获得NS5ATP7融合蛋白的表达,SDS-PAGE、Western blot免疫印迹分析和证实该融合蛋白表达的特异性,并应用生物信息学方法对该融合蛋白的结构和功能进行预测。结果利用RT-PCR扩增获得大小为891bp的NS5ATP7基因片段,插入pET-32a(+)表达载体,转化BL21宿主菌,经IPTG诱导,成功获得了大小为48kD的目的蛋白,Western blot进一步证实了该蛋白具有特异性免疫反应识别。生物信息学预测结果显示此蛋白富含螺旋结构,为非跨膜蛋白,无信号肽。结论利用大肠埃希菌BL21成功表达了NS5ATP7融合蛋白,结合生物信息学分析结果,为研究NS5ATP7蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了基础。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP3的克隆化研究

目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 5A(NS5A)反式激活新型靶基因。方法 以HCVNS5A表达质粒pcD NA3.1( ) NS5A转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3.1( )为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析 ,应用生物信息学方法对所获基因片段序列进行分析发现 ,其中有新型基因片段 ,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索、比对和电子拼接 ,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列 ,确定新型基因序列。从转染了pcD NA3.1( ) NS5A的HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)技术扩增 ,获得阳性克隆之后 ,进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果 该新基因的编码序列全长为 15 72nt,编码产物由 5 2 4aa组成 ,并测序证实 ,命名为NS5ATP3,在GenBank中注册 ,注册号为AF5 2 936 4。结论 分子生物学技术与生物信息学技术相结合 ,发现并鉴定、克隆了HCVNS5A反式激活作用的新型靶基因NS5ATP3。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因1的克隆

目的:应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术(bioinformatics)筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A反式激活新型靶基因,进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制. 方法:以HCV NS5A蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5A 转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析.应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,分析并克隆HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因. 结果:对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,从转染pcDNA3.1(-)-NS5A的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,命名为NS5ATP1. NS5ATP1基因的编码序列全长为1011个核苷酸(nt),编码产物由336个氨基酸残基(aa)组成. 结论:HCV NS5ATP1是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白,而SSH是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术.通过这种技术,发现了HCV NS5ATP1反式激活作用的新的靶基因,这一发现,为进一步研究HCV NS5ATP1蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础.

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP5的克隆

目的:应用抑制性消减杂交技术及生物信息学技术筛选并克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白5A(HCV NS5A)反式激活新型靶基因.方法:以 HCV NS5A 表达质粒 pcDNA3.1(-)-NS5A 转染HepG2细胞,以空载体 pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA 并进行抑制性消减杂交(SSH)分析.对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,与 GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性,利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,进行电子拼接,根据基因起始密码子的 Kozak 规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列.从 HepG2细胞提取总 RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实.结果:NS5ATP5基因的编码序列全长为1191个核苷酸(nt),编码产物由396个氨基酸残基(aa)组成.命名为NS5ATP5,在 GenBank 中注册,注册号为 AF529366.结论:HCV NS5A 反式激活新型靶基因 NS5ATP5的筛选与克隆,为进一步研究 HCV NS5A 反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础.

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因NS5ATP13的克隆化研究

目的 应用微矩阵 (microarray)技术 ,结合生物信息学 (bioinformatics)技术筛选并克隆丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白5A(NS5A)的反式激活基因 ,阐明慢性HCV感染、肝纤维化及肝细胞癌 (HCC)的等相关疾病的发病机制。方法 根据HCV H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物。以含有全长HCV H株cDNA的pBRTM 3 0 11质粒DNA作为模板 ,进行多聚酶链反应 (PCR)扩增 ,获得的HCVNS5A编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定 ,构建真核表达载体pcDNA3 1(-) NS5A。以pcD NA3 1(-) NS5A转染肝母细胞瘤细胞系HepG2 ,提取总RNA ,逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析。应用分子生物学技术 ,结合生物信息学技术 ,克隆HCVNS5A反式激活作用的新的靶基因。结果 构建了真核表达载体pcDNA3 1(-) NS5A ,经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误。以pcDNA3 1(-) NS5A转染HepG2后提取总RNA ,逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS5A反式激活的新型靶基因 ,命名为NS5ATP13 ,在GenBank中登录 ,登录号为D2 12 62。NS5ATP13基因的编码序列全长为 2 10 3个核苷酸 (nt) ,编码产物由 70 0个氨基酸残基 (aa)组成。结论 丙型肝炎病毒NS5A基因产物具有显著的反?

丙型肝炎病毒NS5A蛋白的反式激活作用研究

0引言 丙型肝炎病毒(HCV)是一种单股正链RNA病毒,编码一种多蛋白分子,在病毒和宿主细胞蛋白酶的共同裂解作用下,至少裂解为3种结构蛋白(C、E1和E2)和6种非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)[1,2].NS5 A是非结构蛋白的一种,哺乳动物细胞表达的NS5A蛋白以两种形式存在,分子量分别为56 kD和58 kD.HCV NS5A是HCV基因组编码的一种最为重要的具有多种生物学活性的非结构蛋白质[3-5],是HCV基因组编码的一种具有反式激活作用等多种生物学活性的非结构蛋白质.其基因序列的变异,决定部分HCV病毒株对于IFN-α治疗的疗效应答.HCV NS5A蛋白还具有结合双链RNA激酶(PKR)的生物学活性,对于HCV感染的靶细胞的细胞周期与细胞凋亡的分子生物学调节机制密切相关[6].

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP7的克隆

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学技术筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活新型靶基因. 方法:以HCV NS5A表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5A转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行SSH分析.对于所获基因片段序列分析表明, 其中之一为新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源陛,利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,进行电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列.从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,命名为NS5ATP7,在GenBank中注册,注册号为AF529368. 结果:NS5ATP5基因的编码序列全长为894个核苷酸(nt), 编码产物由297个氨基酸残基(aa)组成. 结论:HCV NS5A反式激活新型靶基因NS5ATP5的筛选与克隆,为进一步研究HCV NS5A反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础.

抑制性消减杂交技术筛选NS5ATP13蛋白的上调基因

目的 应用抑制性消减杂交 (SSH)技术构建丙型肝炎病毒 (HCV)NS5ATP13蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库 ,克隆HCVNS5ATP13蛋白反式激活靶基因。方法 以HCVNS5ATP13表达质粒pcDNA3 .1(-) NS5ATPl3转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1(-)为对照 ;制备转染后的细胞裂解液 ,从中提取mRNA并合成cDNA ,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成两组 ,分别与两种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR ,将产物与T/A载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析。结果 成功构建人HCVNS5ATPl3蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到 10 2个白色克隆 ,进行菌落PCR分析 ,其中 96个均得到 10 0～ 10 0 0bp插入片段。挑取 40个插入片段测序分析 ,其中 2个cDNA片段为未知序列 ,通过生物信息学分析获得其全长序列 ,已被GenBank收录 ,另有 3 4个为已知功能序列。结论 成功筛选出 2个新的cDNA序列 ,并获得其全长序列 。

丙型肝炎

利用RD技术对HCV-1b基因片段的克隆与分析，复合干扰素再治疗慢性丙型肝炎过程中HCV RNA基线载量及定量变化对疗效预测的意义，应用抑制性消减杂交技术筛选丙型肝炎病毒E1蛋白反式激活基因，丙型肝炎病毒E2结合蛋白1结合蛋白的酵母双杂交筛选研究，丙肝病毒NS5A蛋白对NS5B的RdRP活性影响的研究，丙型和庚型肝炎病毒混合感染母婴传播的研究，铕标记基因探针半定量检测丙型肝炎病毒RNA。

丙型肝炎

丙型肝炎病毒NS5A蛋白对Huh7细胞周期的影响；丙型肝炎病毒非结构蛋白4A反式激活基因NS4ATP1的克隆化研究；丙型肝炎病毒感染人端粒酶逆转录酶基因转导后细胞的研究；大肠杆菌高效表达的HCV E2蛋白在丙型肝炎检测中应用；丙型肝炎病毒非结构蛋白3蛋白酶抑制剂的研究进展（综述）。