基因表达谱芯片筛选NS5ATP3转染细胞差异表达基因

目的:应用基因芯片技术.检测丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活基因NS5ATP3的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响.进一步阐明NS5ATP3蛋白可能的分子生物学功能.方法:没计并合成NS5ATP3基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS5ATP3蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的NS5ATP3编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDN.A3.1(-)-NS5ATP3.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.提取高质量的mRNA,逆转录为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1152个基因表达谱的筛选中,发现有6个基因表达水平显著上调,18个基因表达水平显著下调.结论:应用基因表达谱芯片技术成功筛选了NS5ATP3转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明NS5ATP3蛋白可能的生物学功能提供依据.

NS5ATP3通过调节胆固醇代谢促进HepG2细胞生长

目的探讨NS5ATP3在非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)相关肝细胞癌(hepatic cell carcinoma,HCC)发生发展中的作用机制。方法转染pNS5ATP3或si-NS5ATP3后检测HepG2细胞内总胆固醇(total cholesterol,TC)水平,分别采用CCK8法、划痕实验、Caspase-3活性检测法检测细胞增殖、凋亡及迁移情况。通过聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和Western blot检测胆固醇合成、细胞增殖、凋亡及细胞周期相关基因和蛋白(SREBP2、HMGCR、FoxM1)的表达。比较共转染pNS5ATP3和si-HMGCR与单纯转染pNS5ATP3时下游HCC关键基因FoxM1的表达水平及细胞增殖能力。结果NS5ATP3过表达增加了细胞内TC水平[(0.044±0.008)pmol/mg vs(0.034±0.004)pmol/mg;t=3.231,P=0.023)],而NS5ATP3沉默后降低了TC水平[(0.025±0.002)pmol/mg vs(0.033±0.003)pmol/mg;t=3.846,P=0.009)]。Western blot表明,与对照组相比,过表达NS5ATP3可引起SREBP2和HMGCR蛋白水平增加,p-AMPKα水平显著降低;沉默NS5ATP3后,SREBP2和HMGCR蛋白水平下降,p-AMPKα水平增高。qRT-PCR结果也显示,与对照组相比,NS5ATP3过表达上调SREBP2 mRNA(2.45±0.75 vs 1±0.33;t=5.159,P=0.037)和HMGCR mRNA(2.30±0.30 vs 1±0.10;t=4.432,P=0.047)的表达,而沉默NS5ATP3后,SREBP2 mRNA(0.24±0.21 vs 1±0.26;t=4.769,P=0.041)和HMGCR mRNA(0.47±0.13 vs 1±0.21;t=4.522,P=0.046)表达水平显著下降。在48 h和72 h时,过表达NS5ATP3组细胞相对活力显著高于对照组(1.85±0.06 vs 1.56±0.12,t=4.583,P=0.010;3.08±0.19 vs 2.61±0.21,t=4.790,P=0.009),24 h时差异无统计学意义(1.10±0.06 vs 1±0.08,t=1.873,P=0.088)。在24 h、48 h和72 h时,沉默NS5ATP3组细胞相对活力均显著低于对照组(0.90±0.07 vs 0.98±0.09,t=3.378,P=0.020;1.57±0.05 vs 1.63±0.11,t=2.717,P=0.035;1.82±0.23 vs 2.61±0.21,t=5.010,P=0.004)。与对照组相比,过表达NS5ATP3后,细胞中caspase-3/7水平降低(0.69±0.09 vs 1±0.15;t=3.128,P=0.026),而沉默siNS5ATP3后,caspase-3/7活性增高(1.34±0.11 vs 1±0.05;t=5.141,P=0.004)。在24 h、48 h和72 h,过表达NS5ATP3后,细胞迁移率显著升高(21.00±2.08 vs 33.33±2.40,t=3.879,P=0.018;67.33±1.20 vs 78.00±1.53,t=5.488,P=0.005;85.33±2.60 vs 99.00±0.58,t=5.125,P=0.007);沉默NS5ATP3后,细胞迁移能力显著下降(36.00±2.65 vs 24.33±2.91,t=2.969,P=0.041;67.33±1.20 vs 48.00±3.22,t=5.633,P=0.005;92.33±1.45 vs 83.33±1.67,t=4.070,P=0.015)。过表达NS5ATP可显著上调FoxM1 mRNA(1.43±0.10 vs 1±0.06;t=3.533,P=0.024)和CCNB1 mRNA表达(2.07±0.16 vs 1±0.28;t=4.305,P=0.013);沉默NS5ATP3可显著下调FoxM1 mRNA(0.47±0.17 vs 1±0.21;t=3.153,P=0.034)和CCNB1 mRNA(0.49±0.20 vs 1±0.11;t=3.676,P=0.021)的表达水平。Western blot表明,过表达NS5ATP3后,FoxM1和Bcl-2的蛋白质表达水平上调;沉默NS5ATP3后,FoxM1和Bcl-2的蛋白表达水平下调。HMGCR基因沉默后FoxM1 mRNA(0.63±0.18 vs 1±0.17;t=2.698,P=0.036)和蛋白质表达水平均显著下降,提示FoxM1受HMGCR调控。与单纯过表达NS5ATP3相比,同时过表达NS5ATP3和沉默HMGCR,HMGCR mRNA(0.83±0.17 vs 2.13±0.26;t=7.776,P=0.016)和FoxM1 mRNA(0.92±0.21 vs 1.48±0.10;t=4.323,P=0.049)表达水平均显著下降,48 h细胞增殖相对活力也显著降低(0.91±0.18 vs 1.33±0.04;t=4.946,P=0.016)。结论NS5ATP3通过HMGCR-FoxM1轴参与HCC的发生发展,部分解释了NAFLD相关HCC的分子机制。